[發明專利]一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201910095604.1
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109694400A
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 高光;崔院平;程遠政
• 申請（專利權）人: 蘇州高泓利康生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/135
• 分類號: C07K14/135;C12N15/45;C12N15/85
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 蔣慧妮

1.一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ:ID:NO:1。

2.根據權利要求1所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、選取RSV病毒F蛋白的胞外段，所述胞外段的序列為SEQ:ID:NO:2，將其中的Furin切割區域進行點突變，并在N端添加CD5信號肽、C端添加GCN4片段，按照人類的密碼子偏好性進行密碼子優化，合成該優化的基因，并亞克隆至pcDNA3.1-Neoless表達載體中，測序驗證無誤后，使用Qiagen質粒大量抽提試劑盒制備去內毒素質粒；

S2、選取293F細胞解凍后轉移至離心管中，并加入預熱至室溫的FreeStyle? 293培養基，混勻后室溫離心5分鐘，去掉上清后，用FreeStyle? 293培養基重懸細胞后，將細胞懸液轉移至搖瓶中，連續培養，調整細胞至對數生長期；

S3、將轉染試劑及上述構建的可溶性F蛋白表達載體混合均勻；取1×PBS緩沖液至6孔板中，加入pcDNA-CMV-Soluble F protein質粒后充分混勻，加入轉染試劑，混勻，室溫下靜置10分鐘；

S4、將上述轉染復合物加入到293F細胞中充分混勻，將細胞置于37℃、5% CO₂培養箱，培養6~8小時后，加入新鮮的FreeStyle? 293培養基，將細胞重新放回培養箱中繼續培養；

S5、連續培養7天后，離心收集培養基上清，用濾膜過濾，濾液轉至無菌離心管中，使用體外免疫層析檢測試劑檢測卡進行檢測后，繼續用帕利珠單抗磁珠親和層析純化目的重組蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S1中CD5信號肽的序列為SEQ:ID:NO:3。

4.根據權利要求2所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S1中GCN4片段的序列為SEQ:ID:NO:4。

5.根據權利要求2所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S2中所述細胞懸液在搖瓶中連續培養期間，當細胞密度達到2*10^6細胞/mL時，進行稀釋傳代，細胞的接種密度為5*10^5細胞/mL。

6.根據權利要求2所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S3中轉染試劑為LVTransm轉染試劑。

7.根據權利要求6所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S4中轉染復合物為DNA/ LVTransm。

8.根據權利要求2所述的一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的制備方法，其特征在于：所述S5中體外免疫層析檢測試劑檢測卡為 Alere BinaxNOW? RSV 檢測卡。