[發明專利]一種直擴型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多態性的檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201910093064.3
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109609627A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 劉榮兵;徐賽濤;李楊
• 申請（專利權）人: 上海酷樂生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

本發明涉及一種直擴型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多態性的檢測組合物，其包括檢測組合物1～檢測組合物4中的至少一種；其中，檢測組合物1為針對MTHFR C677T位點的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列；檢測組合物2為針對MTHFR A1298C位點的SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示序列；檢測組合物3為針對MTRR A66G位點的SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示序列；檢測組合物4為針對MTR A2756G位點的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示序列。本發明還涉及一種含有上述檢測組合物的試劑盒及檢測方法。本發明采用免提取核酸直擴PCR技術，避免了DNA提取的繁瑣步驟；克服了傳統SNP分型一個管只能區分一個SNP位點多態性，創新性的使用多重標記的TaqMan?MGB熒光探針，可以實現一管區分兩個SNP位點多態性，其具有良好的特異性和快速的敏感性。

技術領域

本發明屬于體外基因檢測技術領域，尤其涉及一種直擴型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多態性的檢測組合物、檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

葉酸，是一種水溶性維生素，人體自身無法合成，必須要通過外界攝取。雖然含葉酸的食物很多，但由于天然的葉酸極不穩定，受照射、加熱易氧化，所以人體真正能從食物中獲得的葉酸并不多。葉酸代謝能力是指葉酸被人體吸收與利用的能力，主要指參與同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉化過程。近年來對其代謝過程機制的研究發現，除了早產、流產先天性心臟病、神經管畸形、唐氏綜合征與葉酸代謝有關外，其他的疾病也與葉酸的代謝異常相關，像是唇腭裂、妊娠晚期并發癥、不同類型的神經和精神疾病、骨質疏松征及大腸癌MTRR(A66G)等癌癥，另外，許多文獻報道，老年期癡呆癥等有關腦病變疾病與葉酸的缺乏有著直接或者間接的關系，葉酸缺乏還可能引起妊娠毒血癥、壞血病、寄生蟲病和類風濕性關節炎等多種疾病，以及其他諸如舌炎、腹瀉、生長不良、精神萎縮和智力退化等癥狀。

葉酸可引起發癌細胞凋亡，對癌細胞的基因表達有一定影響，故屬于一種天然抗癌維生素。而葉酸補充不足，將會誘發心梗、腦梗等心腦血管疾病，同時，也會增加患各項腫瘤的風險。人與人之間因基因不同，對葉酸的代謝吸收能力也不同。通過此項基因檢測，可了解自身的葉酸代謝能力，實現個體化補充葉酸，降低相關疾病的發病風險。

目前研究較為成熟的有四氫葉酸還原酶(MTHFR)的C677T和A1298C位點，蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)上的A66G位點和MTR A2756G位點。

MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，后者是同型半胱氨酸(HCY)代謝產生蛋氨酸的一碳單位供體。C677T位點的基因多態性會導致丙氨酸被纈氨酸代替，這會導致酶活性下降，產生中度的高同型半胱氨酸血癥(HHCY)，也會降低血液中葉酸的含量。全基因組聯合會(GWASs)已經證實了C667位點基因型與健康人群血液中的HCY水平相關。進一步的研究表明，A1298C和C677T兩個位點的雙重突變會導致酶活更嚴重降低。

MTRR是HCY代謝中另一種重要的酶，它在維生素B12的參與下催化HCY形成蛋氨酸。該基因最常見的突變位置為66處的A突變為G，導致酶活下降，HHCY風險上升，而MTR基因A2756G多態性與高甘油三酯對GGT水平升高具有交互作用。

對于單基因位點SNP分型方法主要有：PCR-RFLP、PCR-芯片雜交法、一代DNA測序法和TaqMan MGB基因分型法。PCR-RFLP主要依賴于靶標的限制性酶切位點，實驗難度增大，同時后續的電泳分析容易引起實驗室污染，無法大規模臨床開展。PCR-芯片雜交法是將PCR技術與基因芯片技術結合使用的，同樣有步驟復雜和實驗室交叉污染的風險，影響檢測結果判讀，一代測序是基因檢測的金標準，但是其操作流程過長，成本過高，同時儀器昂貴也難以適合在醫院大規模開展。TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變(SNP)。