[發明專利]靶向編輯羊繁殖負調控基因NPFFR1的sgRNA及其編碼DNA和應用

有效

• 申請號: 201910091124.8
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109652421B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 劉國世;李廣棟;張魯;連正興;呂東穎;姚昱君;朱天奇;姬鵬云
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供了靶向編輯羊繁殖負調控基因NPFFR1的sgRNA及其編碼DNA和應用，屬于CRISPR/Gas9技術領域。本發明的sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示，轉錄所述sgRNA序列的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。本發明提供的sgRNA能特異識別羊NPFFR1基因，引導Cas9核酸內切酶高效切割編碼區，打靶效率在90％以上。基于本發明提供的sgRNA構建Cas9/sgRNA表達系統可實現在細胞或個體水平上對羊NPFFR1基因進行靶向修飾，用于研究羊繁殖調控基因功能及培育新品種基因編輯羊。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別是CRISPR/Gas9技術領域領域，具體地說，涉及特異靶向羊NPFFR1基因的sgRNA及其編碼DNA和應用。

背景技術

動物繁殖是一個十分復雜的生理過程，其受諸多因素的調控，下丘腦-垂體-性腺軸是調控繁殖最重要的軸線。哺乳動物進入初情期后，下丘腦以脈沖的形式釋放促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)到垂體門脈系統，然后到達腺垂體，分別促進促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的合成和釋放，這兩種促性腺激素到達卵巢后，協同促進卵泡發育、成熟及排卵。排出卵子的數量直接決定了動物的繁殖效率。單胎動物每個發情周期往往只排出一個成熟的卵子，這樣嚴重降低了其繁殖力，究其原因是非常復雜的，諸多因素參與調控這一過程，其中促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)是最關鍵的負調控因子。其既能夠直接抑制促性腺激素的合成與釋放，又能間接作用于性腺，從而抑制配子發生。研究人員發現，免疫抑制動物機體內的GnIH能夠促進更多的卵子發育成熟及排出，進而提高其繁殖力。

NPFFR1為GnIH的天然受體，GnIH發揮作用離不開其受體，GnIH和NPFFR1結合后以自分泌或旁分泌的方式抑制生殖。NPFFR1基因在哺乳動物發情前期和間情期表達量最高，而在發情期表達量最低，表明NPFFR1是繁殖負調控的直接因子。2014年研究人員將小鼠的NPFFR1基因敲除后發現其后代平均產仔數顯著增加且身體健康，進一步說明該基因的抑制狀態解除后，GnRH信號通路促生殖效應得到加強。

目前為止，在應用于生產的豬、牛、羊等大型家畜的基因編輯和分子育種中，研究最多的是肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)和成纖維細胞生長因子5(fibroblast growthfactor 5,FGF5)基因的敲除。其中MSTN是肌肉生長的負調控因子，將其敲除后動物產肉量明顯增加；FGF5對哺乳動物的毛發生長具有抑制作用，將其敲除后動物產毛量顯著增加。受以上研究的啟發，發明人試圖通過類似的手段尋求一種能夠增加大型家畜后代產仔(羔、犢)數的方法。除了豬是多胎外，牛和羊等家畜大都是單胎，若能使其產多胎，則對畜牧業生產意義重大。經過聯合分析，最終選定NPFFR1基因為研究對象，如果大動物NPFFR1基因敲除后的表型與小鼠的近似，則其將成為繼MSTN和FGF5基因之后又一對生產實踐具有重要價值的基因。

自最早的基因編輯技術鋅指核酸酶(ZFNs)問世以來，新的基因編輯技術發展如火如荼，先后又誕生了轉錄激活因子類似效應因子核酸酶(TALENs)和RNA指導的CRISPR/Cas核酸酶系統。前兩種技術是將DNA結合蛋白組件與核酸內切酶催化結構域連接，在特定的基因位點誘導靶向DNA雙鏈斷裂(DSB)，其構建過程均較為繁瑣。CRISPR-Cas9是一種微生物適應性免疫系統，使用RNA引導的核酸酶切割DNA。相比于ZFN和TALEN，CRISPR-Cas9系統操作更簡單，效率也更高。如果能篩選到高效且特異性靶向編輯NPFFR1基因的CRISPR-Cas的gRNA序列，引導Cas9核酸酶對該位點進行靶向編輯，就能為制備NPFFR1基因編輯羊和新品種培育提供有力的技術支撐。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效且特異靶向羊NPFFR1基因的sgRNA及其應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：