[發明專利]一種致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201910090429.7
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN110093428B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 蘇秀榕;周君;蘆晨陽;韓姣姣;李曄
• 申請（專利權）人: 浙江正合谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

本發明公開了一種致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒，特點是包括8種致病性弧菌的LAMP檢測引物組，特點是基因序列如SEQ ID NO.1～NO.32所示，還包括樣品模板、10×反應緩沖液、MgSO₄、dNTP、BstDNA聚合酶和雙蒸水，優點是特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低和無假陰性結果。

技術領域

本發明涉及一種致病性弧菌檢測試劑盒，尤其是涉及一種致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒。

背景技術

弧菌屬廣泛存在于海水、海底沉積物以及魚貝蝦蟹等海產品中。人類食用受該類菌污染的食物后會引起腹瀉、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應，重癥患者還會脫水、休克，甚至死亡。近年來的報道顯示，副溶血性弧菌引發的食物中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均已超過沙門氏菌，躍居我國細菌性食物中毒的首位。因此，發明一套高通量、快速、準確、全面的、檢測常見致病性弧菌方法和分型技術是保障食品質量安全和應對水產品食物中毒事故的關鍵。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、泛存在于海水和海產品中，是我國沿海地區常見的食物中毒病原菌，主要來自海產品或鹽腌漬品，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉。創傷弧菌（Vibrio vulnificus）主要通過傷口接觸海水造成感染，也可經口感染，感染時可導致蜂窩織炎及骨髓炎等多種炎癥，經口感染時常迅速導致菌血癥或敗血癥。霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高，屬于國際檢疫傳染病。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是養殖對蝦的重要致病菌，引起的水產養殖動物疾病在世界范圍內流行，也是許多養殖魚類的致病菌，它會造成海水養殖業巨大的經濟損失。還有溶藻弧菌、河流弧菌、燦爛弧菌、擬態弧菌和強壯弧菌等都是近些年來引起水產病害的元兇。因此，亟需一種致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒，實現快速定量檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種致病性弧菌的高通量定量檢測試劑盒，包括8種致病性弧菌的LAMP檢測引物組，其基因序列如下表1所示：

表1

所述的檢測試劑盒的LAMP反應體系及各成分的終濃度如下：樣品模板DNA 1μL，2.5μL 10×反應緩沖液，1.5μL濃度為100mM 的MgSO₄，3.5μL 濃度為10mM 的dNTP，1μL濃度為8 U/μl Bst DNA 聚合酶，1μL FIP/BIP引物組溶液，1μL F3/B3引物組溶液和4μL甜菜堿，然后用雙蒸水補足25μL；其中所述的FIP/BIP 引物組溶液分別為表1所示的副溶血弧菌、創傷弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌和燦爛弧菌的FIP/BIP引物組溶液，各引物終濃度均為40 μM，所述的F3/B3引物組溶液分別為表1所示的副溶血弧菌、創傷弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌和燦爛弧菌的F3/B3引物組溶液，各引物終濃度均為5 μM。

所述的檢測試劑盒還包括顯色劑，所述的顯色劑為鈣黃綠素/氯化錳溶液或者羥基萘酚藍溶液或者SYBR-Green I，其中鈣黃綠素/氯化錳溶液中鈣黃綠素濃度為75μM，氯化錳濃度為 500μM；所述的羥基萘酚藍溶液濃度為150μM，所述的鈣黃綠素/氯化錳溶液或者所述的羥基萘酚藍溶液的添加量為1μL/孔，所述的SYBR-Green I顯色劑的添加量為5μL/孔。