[發明專利]一種魚油及其與棕櫚油混合物的DNA提取與應用方法

有效

• 申請號: 201910089970.6
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109609599B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 李風鈴;王印庚;姚琳;江艷華;鐘友歡;翟毓秀;尚德榮
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 彭友誼

1.一種鑒別魚油中摻加棕櫚油的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

（1）水相制備：取魚油樣品、無菌ddH₂o置于滅菌燒杯中，魚油樣品與無菌ddH₂o的體積比為10：1，充分混勻后置于磁力攪拌器中攪拌1h，4 ℃條件下12000 rpm離心2 min，棄上層油脂，向下層水相再次加入相同體積的魚油，重復上述操作3次，保存水相；

（2）裂解消化：取2 ml步驟（1）中的水相至離心管，加入等體積預熱至65 ℃的CTAB裂解液與蛋白酶K，渦旋混勻，65 ℃溫育30 min，得樣品裂解液；

（3）分步抽提：對步驟（2）中的樣品裂解液先使用等體積平衡酚進行抽提1次，對上清液再進一步使用等體積氯仿：異戊醇混合液抽提2次，所述混合液中氯仿：異戊醇的體積比為24：1，得上清液，放置5 min，然后4 ℃條件下12000 rpm離心10 min；

（4）沉淀DNA：取步驟（3）中的上清液，加入0.8倍體積的-20℃預冷的異戊醇和0.1倍體積的3mol/l NH₄Ac，顛倒混勻后全部轉移至核酸純化吸附柱，收集液于-20℃靜置30min后再次轉入核酸純化吸附柱，取出吸附柱，棄去收集管內液體，用1ml體積分數為75%的乙醇溶液沖洗吸附柱，室溫下靜置5min，使乙醇充分揮發；隨后將吸附柱取出放入新的離心管，向吸附柱中加入50 μl TE溶液，靜置3min，4 ℃條件下12000 rpm離心1 min，DNA溶液即被收集在離心管中；

（５）用無菌ddH₂o將DNA沉淀溶解，加入RNase酶，保存待用；選擇16s-rRNA為內參引物，DXS為目的基因引物，序列分別為SEQ NO.1、SEQ NO.2，以所述方法獲得的DNA作為模板，每個反應作3個重復，反應體系為表1；

表1.熒光定量反應體系

TMII（Tli RNaseH Plus）]]>	10 μl
Rox Reference Dye II	0.4 μl
sense primer	0.2 μl
Anti-sense primer	0.2 μl
DNA	1 μl
2O]]>	8.2 μl
總體積	20 μl

反應條件為：94℃，30 s；94℃ 5 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s， 44個循環；

（６）結果判定：PCR反應結束后，比較收集得到的熒光曲線，不摻有棕櫚油樣品中DXS基因未見擴增，其動力學曲線近似直線，摻雜有棕櫚油樣品DXS基因擴增的動力學曲線出現單峰，有可見特異性擴增。