[發明專利]一株生產凝膠態黃原膠的基因工程菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201910089794.6
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109706110A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 馬挺;吳萌萌;李國強;史忠
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/90;C12P19/06;C12R1/64
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一株生產凝膠態黃原膠的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以Xanthomonascampestris NK-01為出發菌株，在所述出發菌株中敲除乙酰基轉移酶Ⅰ基因gumF和乙?；D移酶Ⅱ基因gumG，并且過表達酮基轉移酶基因gumL；

所述Xanthomonas campestris NK-01的菌種保藏編號為CGMCC No.15155。

2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述過表達酮基轉移酶基因gumL是通過向所述出發菌株中轉入包含酮基轉移酶基因gumL的多拷貝表達質粒pBBRL實現。

3.權利要求1或2所述的基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

1)敲除所述出發菌株中的gumF基因和gumG基因，獲得gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)；

2)在步驟1)中所述的gumF基因和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中過表達酮基轉移酶基因gumL獲得基因工程菌。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中敲除所述出發菌株中的gumF基因和gumG基因包括以下步驟：

1.1)以所述出發菌株的基因組為模板，進行PCR擴增獲得基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段；所述基因gumF的上游同源臂片段的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示；所述基因gumG的下游同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

1.2)將步驟1)獲得的所述基因gumF的上游同源臂片段和基因gumG的下游同源臂片段通過overlap PCR重組后，連接至自殺質粒pLO3中，獲得無痕敲除質粒plO3-FG；

1.3)將步驟2)中所述無痕敲除質粒plO3-FG轉入出發菌株中進行gumF和gumG基因的敲除獲得gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)。

5.根據權利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟2) 中所述過表達酮基轉移酶基因gumL包括以下步驟：

2.1)將酮基轉移酶基因gumL與載體pBBR1mcs-2連接獲得多拷貝表達質粒pBBRL；

2.2)將步驟2.1)中所述多拷貝表達質粒pBBRL轉入到所述gumF和gumG基因缺失的菌株XC(△FG)中獲得基因工程菌XC(△FG::pBBRL)。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1.3)中所述的轉入為接合轉移，所述出發菌株和無痕敲除質粒plO3-FG的數量比為1：(1.5～2.5)；所述接合轉移的溫度為28～32℃，所述接合轉移的時間為8～12h。

7.一種利用權利要求1或2所述基因工程菌生產黃原膠的方法，包括以下步驟：

S1)將所述基因工程菌接種到種子培養基中進行活化獲得活化菌液；

S2)將所述活化菌液接種到發酵培養基中進行發酵培養獲得發酵液；所述發酵培養的溫度為28～32℃，所述發酵培養的時間為60～84h；

S3)醇沉所述發酵液，收集固相組分為黃原膠。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S1)中所述活化菌液的菌濃度OD₆₀₀為0.4～0.6。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟S2)中所述活化菌液的接種量為8～12％(V/V)。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述發酵培養的培養基以1L計，包括以下組分：玉米淀粉，40～60g；魚蛋白胨，3.5～4.5g；碳酸鈣，3.5～4.5g和余量的水。