[發明專利]準確鑒別插入突變純、雜合線蟲的三引物組及PCR鑒別方法

在審

• 申請號: 201910089793.1
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109576381A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 趙培;康雅虹;廖加磊
• 申請（專利權）人: 蘇州上源生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

1.準確鑒別插入突變純、雜合線蟲的三引物組，其特征在于，所述三引物組由上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S組成。

2.根據權利要求1所述的三引物組，其特征在于，所述上游引物WT-S設置在所述插入突變的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物WT-A設置在所述插入突變的3’下游200bp-700bp位置，所述第三引物I-S設置在所述插入突變被插入的序列上。

3.根據權利要求1所述的三引物組，其特征在于，所述上游引物WT-S與下游引物WT-A以及所述第三引物I-S與下游引物WT-A的G、C堿基百分比相差不超過10％，總堿基個數相差不超過2個堿基，且無引物間二聚體。

4.根據權利要求1所述的三引物組，其特征在于，所述上游引物WT-S對和下游引物WT-A組成第一引物對，第三引物I-S和下游引物D-A組成第二引物對，所述第一引物對和第二引物對的退火溫度相同。

5.根據權利要求1所述的三引物組，其特征在于，所述第一引物對擴增野生型模板DNA后得到的片段大小為600-1200bp，所述第二引物對擴增插入突變模板DNA后得到的片段大小為600-1200bp。

6.根據權利要求5所述的三引物組，其特征在于，所述第二引物對擴增插入突變模板DNA后得到的片段比第一引物對擴增野生型模板DNA后得到的片段長100bp-350bp。

7.三引物組用于插入突變純、雜合線蟲的PCR鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

引物設計：利用引物設計軟件進行三引物設計，所述三引物為權利要求1-6中任一項所述的上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S，且所述上游引物WT-S和下游引物WT-A組成第一引物對，所述第三引物I-S和下游引物WT-A組成第二引物對；

獲取需要鑒定的線蟲DNA模板；

確定最適退火溫度：以野生型線蟲為模板，分別使用所述第一引物對和第二引物對，進行溫度梯度PCR，尋找兩個引物對都能PCR擴增出條帶正確且亮度合適的退火溫度；

三引物組PCR：將所述上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S同時加入PCR混合液中，作用于需要鑒定的線蟲DNA模板進行競爭性PCR，得到PCR產物；

將所述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析譜圖，得出結果。

8.根據權利要求7所述的PCR鑒別方法，其特征在于，所述三引物組PCR步驟中用的PCR體系為：

10xpfu擴增緩沖液，1μL；

濃度為10mM的dNTP，0.2μL；

Pfu高保真酶，0.5μL；

濃度為100μM的所述上游引物WT-S，0.05μL；

濃度為100μM的所述下游引物WT-A，0.05μL；

濃度為100μM的所述第三引物I-S，0.05μL；

需要鑒定的線蟲DNA模板，0.5μL；

重蒸餾水，7.65μL。

9.根據權利要求8所述的PCR鑒別方法，其特征在于，將所述三引物組PCR步驟的工藝條件為：

94℃1min30s；

94℃20s；最適退火溫度20s；72℃1min，以上三個步驟30個循環；

72℃5min；

18℃保存。