[發(fā)明專利]高密度長期培養(yǎng)表達抗VEGF人源化單克隆抗體重組CHO細胞的方法

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• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN109628407A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂中華;楊新春;張道旭;張雪亭;孟慶勇;姜媛媛;張磊;高紅梅;王冰;安小麗;梁秋波;汪霖;張譯文;劉姍姍;徐軼爾
• 申請（專利權(quán)）人: 哈藥集團技術(shù)中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C07K16/28;C12M3/00;C12M1/00
• 代理公司: 北京興智翔達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11768
• 代理人: 蔣常雪

1.高密度長期培養(yǎng)表達抗VEGF人源化單克隆抗體重組CHO細胞的方法，其特征在于：按照如下工藝步驟：

(一)準(zhǔn)備工作：將反應(yīng)器內(nèi)注入無菌驗證培養(yǎng)液，并將細胞節(jié)流裝置內(nèi)同時注滿該培養(yǎng)液并進行模擬細胞截留的操作，驗證管路連接的完整性；將反應(yīng)器模擬細胞培養(yǎng)條件運行1-2天進行無菌驗證工作，驗證通過后將驗證用培養(yǎng)液棄掉即可；

(二)接種細胞：將經(jīng)過懸浮馴化的可適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)基的表達抗VEGF人源化單克隆抗體的CHO細胞在從液氮罐中復(fù)蘇后進行培養(yǎng)，在搖瓶中傳2-3代后細胞處于對數(shù)生長期時進行逐級擴增培養(yǎng)，當(dāng)細胞數(shù)量達到接種要求時進行接種，接種后細胞密度一般為0.5×10⁶-2×10⁶個/mL，接種體積可以是反應(yīng)器的最小培養(yǎng)體積，然后繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)至工作體積；

接種后的細胞活率應(yīng)該在90％以上，待細胞密度達到5×10⁶-10×10⁶個/mL時進行細胞截留換液操作；

在進行細胞截留換液操作以前的細胞培養(yǎng)階段可以視為種子細胞擴增期，控制培養(yǎng)參數(shù)為PH：6.8-7.2,之間；DO在30％-80％空氣飽和度；溫度為34℃-37℃；

(三)細胞截留換液操作：該過程可分為兩個階段進行：

第一階段：細胞增殖階段，該階段的目的是促進細胞的快速增殖，在達到所需的細胞濃度時進入第二階段；

在第一階段細胞培養(yǎng)期間，進行細胞培養(yǎng)液置換速率應(yīng)根據(jù)細胞的生長速度、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況進行，一般起始置換體積為20％-50％培養(yǎng)體積/天，然后緩慢增加，待細胞達到所需密度或增殖停止時換液速率穩(wěn)定，一般培養(yǎng)液置換體積為80％培養(yǎng)體積每天；

該階段一般為接種后持續(xù)3-8天；

第二階段：抗VEGF人源化單克隆抗體表達階段在該階段，控制反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)：溫度為36.5℃、PH為7.1-7.3、DO為60％-80％空氣飽和度；

同時，控制細胞密度的穩(wěn)定；控制細胞密度的穩(wěn)定通過以下方式操作：

1)降低培養(yǎng)溫度至32-35℃，同時抑制細胞增殖；

2)或者，通過在灌注培養(yǎng)基內(nèi)添加正丁酸鈉抑制細胞增殖的化合物條件，正丁酸鈉添加量為0.5-1mmol/L；

3)或者，以通過從反應(yīng)器內(nèi)抽取一定量細胞培養(yǎng)液的方式少量棄去細胞以維持細胞密度的穩(wěn)定；

4)或者，通過以上兩種或三種方式結(jié)合使用；

在該階段的細胞截留換液操作中，換液速率也應(yīng)控制穩(wěn)定，在培養(yǎng)液中適當(dāng)添加促進表達的物質(zhì)，該物質(zhì)為0.2％糖基化位點添加劑、4-8mmol/L谷氨酰胺等物質(zhì)。

2.如權(quán)利要求1所述高密度長期培養(yǎng)表達抗VEGF人源化單克隆抗體重組CHO細胞的方法，其特征在于：在該工藝中第(三)步驟細胞培養(yǎng)液置換過程在1個小時以內(nèi)完成濃縮細胞及補充培養(yǎng)液的過程，在進行細胞培養(yǎng)液置換操作中應(yīng)每隔5-20分鐘進行一次反向沖洗操作，即停止懸浮細胞的截留濃縮操作，進行澄清培養(yǎng)液的由膜外向膜內(nèi)的反向沖洗操作，操作過程一般為3-10分鐘，然后繼續(xù)進行懸浮細胞的截留濃縮過程，該過程結(jié)束后向反應(yīng)器內(nèi)補充新鮮培養(yǎng)基，同時對中空纖維柱再進行一次由膜外向膜內(nèi)的反向沖洗過程，最后打開澄清培養(yǎng)基的循環(huán)管路，使中空纖維柱內(nèi)部的培養(yǎng)液體始終處于流動狀態(tài)以防止細胞碎片對膜的進一步堵塞。