[發明專利]一種循環腫瘤細胞分離方法

在審

• 申請號: 201910080904.2
• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN109777775A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 余小玲;王秀娟;呂陽;朱峰;盧彥羽;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N13/00
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 胡建文

1.一種循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)取新鮮外周血血液樣本與PBS溶液混勻置于多孔隔膜離心管的隔膜上層，多孔隔膜離心管的隔膜下層為細胞密度梯度離心液，進行密度梯度離心分離；

2)將經過密度梯度離心后的多孔隔膜離心管的隔膜上層溶液取出置于第一離心管中，離心，去除上清液，得含目的細胞的溶液；

3)在第二離心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再將步驟2)中的含目的細胞的溶液加入至第二離心管，混勻，2～8℃震蕩孵育；

4)將步驟3)中經過孵育的混合液置于磁力架上靜置，將含目的細胞的上清液轉移至第三離心管中，第三離心管進行離心，去除上清液，即得純化的循環腫瘤細胞。

2.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述新鮮外周血血液樣本置于2～8℃環境保存。

3.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述多孔隔膜離心管為15mL離心管中加裝孔徑0.5～0.8mm之間的多孔樹脂隔膜，將離心管分隔成上下兩部分，下半部分可容納3mL液體。

4.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述細胞密度梯度離心液為Percoll分層液和生理鹽水配制而成的密度為1.0500～1.0700g/mL溶液。

5.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述步驟1)具體過程：在底部裝有細胞密度梯度離心液的多孔隔膜離心管中加入4ml新鮮外周血血液樣本與1ml的PBS溶液進行密度梯度離心，且密度梯度離心條件為4℃，1200g，離心25min。

6.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述步驟2)中將密度梯度離心后隔膜上層溶液取出置于第一離心管后，向多孔隔膜離心管中加入PBS溶液清洗多孔隔膜管的管壁和隔膜上層，并將PBS洗滌液并入第一離心管中混合，再對第一離心管內溶液進行離心，離心條件為4℃，200g，離心15min。

7.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述步驟3)中含有CD45和CD15混合磁珠的制備過程：取1.5mL的第二離心管，加入1mL磁珠孵育緩沖液，分別取10μL的CD45beads和5μL的CD15beads至第二離心管中，混勻，將第二離心管放置到磁力架上，靜置2min，去掉液體，保留磁珠，再加入50μL磁珠孵育緩沖液重懸磁珠即可。

8.如權利要求1所述的循環腫瘤細胞分離方法，其特征在于：所述步驟4)中含目的細胞的上清液轉移至第三離心管后，取磁珠孵育緩沖液重懸磁珠，放置于磁力架上靜置2min，將液體并入第三離心管中，再對第三離心管進行離心，離心條件為20℃，200g，離心15min。