[發明專利]衍生醛基嘧啶的方法、檢測5-醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的應用

有效

• 申請號: 201910079972.7
• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN109678802B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 李坤;周倩;余孝其
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C07D239/47
• 分類號: C07D239/47;C07D239/54;C07D471/04;G01N21/64
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 李亞男

本發明公開了一種衍生醛基嘧啶的方法、檢測5?醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的應用。本發明將醛基嘧啶與Wittig試劑于有機溶劑中混合，然后用紫外光進行輻射，制得醛基嘧啶衍生物；其中，醛基嘧啶為5?醛基胞嘧啶或5?醛基尿嘧啶。本發明反應條件溫和、高效快速，有效拓展了Wittig試劑在表觀遺傳學領域的應用，也為醛基嘧啶的化學標記和反應型5fC熒光探針的設計提供了新思路。

技術領域

本發明涉及核酸化學技術領域，具體涉及一種衍生醛基嘧啶的方法、檢測5-醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的應用。

背景技術

哺乳動物細胞或組織DNA中，特別是CpG島，都存在著不同程度的甲基化修飾，這與胚胎發育，腫瘤、精神、血液系統等重大疾病的發生發展密切相關。DNA甲基化是指DNA甲基轉移酶(DNMT)以腺甲硫氨酸為甲基供體在胞嘧啶的5位碳上添加甲基使之轉變為5-甲基胞嘧啶(5mC)的過程，并且此過程是動態可逆的，即DNA去甲基化。DNA去甲基化可分為主動和被動兩種不同的形式。前者是由于DNA甲基化維持機制受到抑制，例如 DNMT1失活，DNA甲基化水平在DNA的連續半保留復制過程中逐漸被稀釋；后者是指在TET等多種酶的參與下，5mC持續氧化并經由一系列中間體最終轉化為胞嘧啶的過程。

5-醛基胞嘧啶(5fC)作為主動去甲基化過程的中間體，對于維持生命體正常的甲基化水平具有重要意義。2015年，有文獻報道稱通過監測不同生長階段小鼠組織DNA中所有胞嘧啶衍生物的含量變化，首次提出5fC是一種穩定的表觀遺傳學修飾，其豐度與其上游產物5-甲基胞嘧啶(5mC)、5- 羥甲基胞嘧啶(5hmC)及下游產物5-羧基胞嘧啶(5caC)沒有必然聯系。另有報道表明，與5hmC、5caC相比，5fC擁有更多的蛋白結合位點及更為獨特的堿基分布規律，使之在基因調控、改變DNA結構、細胞分化及重大疾病等特殊生物事件中扮演著更為重要的角色。

在復雜的生理過程中要想更加深入地研究5fC的生理學功能，關鍵在于開發高選擇性、高靈敏度的檢測技術來準確測定DNA中的5fC水平。

液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)因其自身特點在這方面具有顯著優勢，但是5fC在體內的豐度極低，離子化效率也低，再加上其他高含量經典堿基或稀有堿基以及樣品基質中各種各樣的雜質干擾，使用LC-MS/MS技術準確測定5fC仍然具有一定的挑戰性。

鑒于此，研究者們開始嘗試利用化學反應將一些更為疏水的或易于離子化的基團共價修飾到5fC的骨架上去，從而改善5fC在液相分離時與諸多干擾項的分離分辨率，同時提高在質譜檢測過程中的離子化效率。但是目前，針對5fC的活潑醛基，僅有酰肼和磺酰肼類衍生物涉及到此類應用。但是，這種基于席夫堿反應機理生成的C＝N雙鍵不夠穩定，易于水解，這對本身就比較耗時的LC-MS/MS來說極為不利。

另外，相比于傳統的LC-MS/MS，熒光傳感技術擁有選擇性好、響應時間短、操作簡單、可裸眼觀察等優勢，先后被廣泛應用于活細胞乃至動物體內活性氧、活性硫、酶、核酸等生物靶標的檢測。特別是有機小分子熒光探針因其具有易修飾、成本低等特點，受到了眾多科研工作者的青睞。近年來，著眼于5fC的C-5位醛基，相繼有報道稱其能被-NH2、-NHNH2、-ONH2、吲哚等衍生物熒光標記。然而，5-醛基尿嘧啶(5fU)作為胸腺嘧啶(T)的氧化產物，與5fC的結構極為類似，但其醛基的反應活性遠勝于5fC，所以上述基于席夫堿反應或Aldol縮合的熒光探針將優先與5fU反應。也就是說，這類試劑并不能區分這兩種醛基嘧啶，無法實現5fC的特異性熒光識別。