[發(fā)明專利]一種預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910076621.0
• 申請日: 2019-01-26
• 公開（公告）號: CN109628490A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃娟;單虎;楊雅明
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/66;C12N15/113;A61P31/14
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

1.一種預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，由AAV2/9-N-shRNA3質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞后得到預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒；

其中，所述AAV2/9-N-shRNA3質(zhì)粒是將干擾片段重組至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen載體得到的，所述干擾片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ IDNO.8所示；

所述過表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒分別為為pAAV-RC9質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后，與干擾片段基因連接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，AAV2/9-N-shRNA3質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1.人工合成干擾序列shRNA3：

Top strand：

gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttc

bottom strand：

aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcg

S2.引物退火形成帶粘性末端的雙鏈片段

將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列，退火程序：95℃ 10min，75℃ 10min，55℃10min，35℃ 10min，15℃ 10min；

S3.用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對載體pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen進(jìn)行雙酶切，雙酶切完成后，膠回收；

S4.將S2得到的退火產(chǎn)物和S3經(jīng)過酶切的載體進(jìn)行連接得到連接產(chǎn)物，即可得到AAV2/9-N-shRNA3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，S4中的連接反應(yīng)體系如下：退火產(chǎn)物1μl，酶切好的載體100-200ng，ligase buffer 2μl，T4ligase 1μl，H₂O補(bǔ)齊至20μl，以上連接反應(yīng)體系在16℃過夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，S4中的轉(zhuǎn)化步驟包括：將連接產(chǎn)物以Cacl₂方法轉(zhuǎn)化加入感受態(tài)細(xì)胞，于Amp抗性平板，37℃條件下培養(yǎng)過夜，得到轉(zhuǎn)化后的N shRNA3，；轉(zhuǎn)化后的N shRNA3平板挑菌，于37℃條件下、250轉(zhuǎn)/分鐘，搖菌14小時，挑取陽性克隆子，保存?zhèn)溆谩?/p>

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌菌株stbl3感受態(tài)細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)染的反應(yīng)體系如下:轉(zhuǎn)染100mm平皿所需的轉(zhuǎn)染復(fù)合物成分如下：10μL過表達(dá)質(zhì)粒+20μLpHelper質(zhì)粒+10μL AAV2/9-N-shRNA3+150μL轉(zhuǎn)染試劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防犬瘟熱的shRNA重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑為Lipo轉(zhuǎn)染試劑。