[發明專利]巢式PCR特異性引物對、試劑盒及其制備方法和在輔助鑒定Ln基因編輯材料中的應用

在審

• 申請號: 201910075642.0
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109628631A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 邱麗娟;文靜;郭勇;郭兵福
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種基因編輯創制大豆窄葉型種質的方法及相關鑒定方法，包括向目的大豆中導入大豆基因組編輯的載體，在W82的基因組上對Ln(Glyma.20g25000)基因進行編輯，在Ln基因的編碼區敲除了4個堿基，使Ln基因發生隱性突變為ln得到窄葉大豆，將其命名為ZH609；大豆基因組編輯的載體含有Cas蛋白基因、sgRNA編碼基因。采用上述方法能夠實現對大豆定點基因編輯，獲得具有窄葉性狀的大豆，具有較高育種價值。本發明還公開了一種巢式PCR特異性引物對和具有其的試劑盒及其制備方法和應用，利用特異性PCR引物擴增的方法，簡便快捷地進行鑒定，從而達到了簡便易行且經濟實用地鑒定Ln基因編輯材料和W82、ZP661等含Ln基因的常規品種，或檢測Ln基因編輯材料后代純雜合情況的目的。

技術領域

本發明涉及巢式PCR特異性引物對和具有其的試劑盒及其制備方法和在輔助鑒定Ln基因編輯材料中的應用，屬于生物技術領域。

背景技術

大豆是我國僅次于玉米、小麥和水稻的第四大作物，是我國主要的糧食和油料作物之一。由于大豆具有極高營養價值、高生理活性和廣泛工業用途，世界對大豆的需求日益增加。大豆產業的發展對解決世界性植物蛋白短缺，改善食物結構，發展有機農業，減少能源消耗和環境污染，具有戰略意義。過去一個多世紀，雖然全球大豆的產量保持持續增長的趨勢，但仍然無法滿足人類對大豆日益增長的需求，提高大豆產量潛力一直是大豆育種的重要任務。

大豆的產量是由單位面積株數、每株莢數、每莢粒數和粒重構成。以上四個產量構成因素中任何一個因素發生變化都會引起產量的增減。周新安等研究發現在一定范圍內增加每莢粒數，是提高大豆單產的一條有效途徑(周新安等，Relation of three-seed andfour-seed pods with yield of RIL in soybeans)。大豆是短日照植物，對反應較敏感，邊際大豆植株透光性好，單株產量往往是內部植株的數倍之多[滕衛麗等，不同葉形大豆品種產量性狀邊際效應指數分析]。因此，大豆葉形的研究對改良大豆植株的空間結構分布、提高大豆產量具有非常重要的意義。

大豆中Ln位點是一個研究已久的經典葉形控制位點，Bernard和Weiss(1973)首次報道窄葉性狀由一個質量基因控制，命名為ln。Takahashi(1934)首次報道窄葉葉形和每莢粒數的關系，指出窄葉大豆傾向于具有更多的4粒莢。Jeong等(2012)定位了ln位點，并指出ln具有一因多效的特性，是控制大豆葉形和每莢粒數的主效位點。

CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，該技術以RNA引導，通過RNA與靶序列間的堿基互補而完成識別過程，這一過程簡單靈活，靶位點的選擇僅需符合不同系統的PAM(protospacer-adjacent motif，PAM)要求即可。此系統的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA(singleguide RNA)，引導Cas9對DNA的定點切割。

發明內容

有鑒于此，本發明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在W82的基因組上對Ln基因進行編輯，使Ln基因發生隱性突變為ln。將編輯后的材料進行田間種植和考種，經過表型觀察和考種數據統計分析，得出編輯后的材料葉形變尖變窄(length/width＝2.3)，四粒莢數顯著性增多，提供了巢式PCR特異性引物對和具有其的試劑盒及其制備方法和在輔助鑒定Ln基因編輯材料中的應用，作為鑒定Ln基因編輯位點和野生材料的標記，用以鑒定Ln基因編輯材料和W82、ZP661等含Ln基因的常規品種，或檢測Ln基因編輯材料后代純雜合情況。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：