[發明專利]一種分泌型靶向Lewis-Y的CAR-T細胞

有效

• 申請號: 201910075310.2
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109666651B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 李甲璐;尚小云;許先進;王丹;馬麗;馬少文
• 申請（專利權）人: 蘇州茂行生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
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1.一種分泌型靶向Lewis-Y的CAR-T細胞，其特征在于，所述CAR-T細胞為表達Lewis-Y-CAR的同時分泌PD-1抗體的CAR-T細胞或表達Lewis-Y-CAR的同時分泌IL12細胞因子的CAR-T細胞,?所述的Lewis-Y-CAR包含scFv區域，該scFv區域用于識別Lewis-Y抗原，該scFv區域序列為經過優化的核苷酸序列，序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.如權利要求1所述的分泌型靶向Lewis-Y的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）從供者提供的外周血中分離PBMC；

（2）從PBMC中活化、分選出CD3陽性T細胞；

（3）構建攜帶Lewis-Y-CAR及抗體或細胞因子基因的慢病毒質粒骨架得到重組慢病毒質粒；

（4）將步驟（3）所得的攜帶Lewis-Y-CAR及抗體或細胞因子基因的重組慢病毒質粒及輔助質粒轉染宿主細胞，制備可感染T細胞的重組慢病毒載體；

（5）將步驟（4）所得的重組慢病毒載體轉導進入步驟（2）分選出的經激活的T細胞，產生表達Lewis-Y-CAR的同時分泌抗體或細胞因子的CAR-T細胞；

（6）將步驟（5）所得細胞體外培養；

（7）將步驟（6）所得細胞大量擴增；

（8）收集表達Lewis-Y-CAR的同時分泌抗體或細胞因子的CAR-T細胞。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，所述的重組慢病毒質粒是二代或者三代的慢病毒轉基因質粒。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，所述的重組慢病毒質粒是第三代慢病毒轉基因質粒；所述的重組慢病毒質粒是靶向Lewis-Y抗原且分泌IL12細胞因子的慢病毒轉基因質粒，重組慢病毒質粒依次包含CMV啟動子序列、Lewis-Y?scFv、Flag、CD8嵌合受體跨膜區、胞內信號傳導區、NFAT啟動子序列、IL12細胞因子序列；步驟（5）中所述的重組慢病毒載體將靶向Lewis-Y抗原的嵌合抗原受體表達在T細胞表面，同時能夠分泌IL12細胞因子。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，所述的重組慢病毒質粒是第三代慢病毒轉基因質粒；所述的重組慢病毒質粒是靶向Lewis-Y抗原且分泌PD-1抗體的慢病毒轉基因質粒，重組慢病毒質粒依次包含CMV啟動子序列、Lewis-Y?scFv、Flag、CD8嵌合受體跨膜區、胞內信號傳導區、EF1α啟動子序列、IL2SS序列、PD-1抗體序列；步驟（5）中所述的重組慢病毒載體將靶向Lewis-Y抗原的嵌合抗原受體表達在T細胞表面，同時能夠分泌PD-1抗體。

6.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述胞內信號傳導區包含編碼共刺激因子區域，該共刺激因子區域選自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特異性結合CD83的配體、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴細胞功能相關的抗原-1(LFA-1)、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一種或多種的任意組合。

7.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述胞內信號傳導區為CD28-4-1BB-CD3ζ。

8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（4）中，所述的輔助質粒有三個，分別為pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pMDLg-pRRE，所述的宿主細胞為293FT或293T細胞。

9.一種混合制劑，包括如權利要求1所述的表達Lewis-Y-CAR的同時分泌PD-1的CAR-T細胞或表達Lewis-Y-CAR的同時分泌IL-12的CAR-T細胞。