[發明專利]一種從基因工程水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白的方法

有效

• 申請號: 201910074848.1
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN111484557B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 楊代常;歐吉權;鄧貝
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/82;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種從基因工程水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白的層析方法，依次包括以下步驟：

1)將含有重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白的轉基因水稻種子脫殼磨碎后加入提取液得到提取混合物；提取液組分為5～20mM磷酸鹽，5～20mM醋酸鈉，10～30mM硫酸銨，10～20mM辛酸鈉，1～5mM還原型谷胱甘肽，pH6.0～8.0；將所述提取混合物的pH調節至4.5～5.9，攪拌酸沉后過濾得到含重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白的粗提液；

2)將粗提液經陽離子交換層析得到初級產物Ⅰ；

所述陽離子交換層析填料為Bestarose?Diamond?MMC；層析步驟為：

2a)使用平衡緩沖液以50-200cm/h的流速平衡層析柱，所述平衡緩沖液組分為20～50mM?NaAc，0～40mM?NaCl，1～5mM還原型谷胱甘肽，1～5mM?EDTA-2Na，pH為4.5～5.5，電導為5～10mS/cm；

2b)以步驟1)中的粗提液為上樣樣品，其電導為5～10mS/cm，pH為4.5～5.5，上樣流速為100～170cm/h；

2c)使用2a)的緩沖液8～10倍柱體積再平衡層析柱，使用3～5倍柱體積的洗雜緩沖液I以100～170cm/h的流速洗脫雜蛋白，所述洗雜緩沖液I的組分為20～50mM?NaAc，10％～15％(V/V)異丙醇，pH為4.5～5.5；

2d)使用20～25倍柱體積的洗雜緩沖液II以100～170cm/h的流速再次洗脫雜蛋白，所述洗雜緩沖液II組分為20～50mM?NaAc，10％～15％(V/V)異丙醇，1.2～1.88M?NaCl，pH為4.5～5.5；

2e)使用洗脫緩沖液以100～170cm/h的流速洗脫目標蛋白，所述洗脫緩沖液的組分為20～50mM磷酸鹽，0.4～0.5M?NaCl，1～5mM還原型谷胱甘肽，1～5mM?EDTA-2Na，pH為6.0～6.5，所得洗脫液即為初級產物I；

3)將初級產物Ⅰ經陰離子交換層析得到純化的重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白；

所述的陰離子交換填料為Q?Bestarose?FF，層析步驟為：

3a)使用平衡緩沖液以50-200cm/h的流速平衡層析柱，所述平衡緩沖液的組分為20～50mM磷酸鹽，1～5mM還原型谷胱甘肽，1～5mM?EDTA-2Na，電導為2.5～9mS/cm，pH為6.0～8.0；

3b)以3a)中的平衡緩沖液為置換液，將2e)步驟所得的初級產物10～30kd的膜包超濾置換，置換后溶液電導為2.5～9mS/cm，調節pH為6.0～8.0，作為陰離子交換層析的上樣液；

3c)使用4～8倍柱體積的3a)步驟的平衡緩沖液以40～70cm/h流速再平衡層析柱，使用9～12倍柱體積的洗雜緩沖液以40～70cm/h流速洗脫雜蛋白，所述洗雜緩沖液的組分為20～50mM磷酸鹽，114～120mM?NaCl，1～5mM還原型谷胱甘肽，1～5mM?EDTA-2Na，電導為13.5～14.5mS/cm，pH為6.4～6.6；

3d)使用洗脫緩沖液以40～70cm/h流速洗脫目標蛋白，所述洗脫緩沖液的組分為20～50mM磷酸鹽，225～350mM?NaCl，1～5mM還原型谷胱甘肽，1～5mM?EDTA-2Na，電導為23.5～35mS/cm，pH為6.4～6.6，所得洗脫液即為純化的重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)的方法為：

1a)將所述轉基因水稻種子脫殼成半精米，并磨碎至細度為80～100目的米粉，將所述米粉與提取液按照比例為1：5～1：10(kg/L)混合得到提取混合物，提取時間為1～2h，提取溫度為25～60℃；

1b)將所述提取混合物的pH用乙酸調整為4.5～5.9進行酸沉，酸沉時間為1～8h，酸沉溫度為4℃～30℃，酸沉方式為慢速攪拌；

1c)將1b)步驟的提取混合物酸沉后離心或用2～5％重量的珍珠巖進行壓濾后，經0.22～0.45μm濾膜微濾得到含重組人血清白蛋白-表皮生長因子融合蛋白的粗提液。