[發明專利]玉米Zm-Prx5基因分子標記、獲得方法及在莖腐病防治中的應用

在審

• 申請號: 201910074121.3
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109680094A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 吳劉記;陳贊;王順喜
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/53;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/46
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

1.一種能夠鑒定玉米莖腐病的分子標記，其特征在于，所述分子標記為如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.6所示的Zm-Prx5基因。

2.一種權利要求1所述的能夠鑒定玉米莖腐病的分子標記的獲得方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，提取玉米的總RNA備用；

步驟2，將玉米總RNA反轉錄成cDNA第一鏈；

步驟3，分子標記的克隆

合成引物：Zm-Prx5F1:5'-AAAACCGGTTGCTATTAGTAC-3'；Zm-Prx5 R1:5'-GAAGAAAACAAAATGTCTGC-3'；

用步驟2反轉錄的cDNA第一鏈作為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系如下：10×PCRBuffer 4μl、dNTP 1μl、Zm-Prx5 F1 0.5μl、Zm-Prx5 R1 0.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、滅菌H₂O 17μl；

PCR結束后瓊脂糖凝膠電泳，回收743bp的條帶，即獲得能夠鑒定玉米莖腐病的分子標記。

3.根據權利要求2所述的能夠鑒定玉米莖腐病的分子標記的獲得方法，其特征在于，將回收743bp的條帶轉化入大腸桿菌感受態細胞中，保存備用。

4.根據權利要求1所述的分子標記在玉米莖腐病防治中的應用。

5.根據權利要求4所述的分子標記在玉米莖腐病防治中的應用，其特征在于，利用所述分子標記Zm-Prx5基因構建能夠穩定表達Zm-Prx5的過表達載體，然后將所述過表達載體轉化入農桿菌感受態細胞中，得到轉化菌，最后用所述轉化菌轉化玉米植株，獲得具有玉米莖腐病抗性的陽性轉基因株系。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Zm-Prx5的過表達載體按照以下步驟構建：

合成引物，如下：Zm-Prx5 R7：5'-ACCCATGGATGGCTCCCATCGCT-3'；Zm-Prx5F7：5'-ACAGATCTCTAAAGCGCCTTCAG-3'，；

以權利要求3含有Zm-Prx5基因的大腸桿菌感受態細胞為模板進行PCR擴增，PCR結束后，瓊脂糖凝膠檢測，回收目的DNA條帶，并將回收的目的DNA條帶與T載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，得到重組質粒PMD-Zm-Prx5；

將重組質粒PMD-Zm-Prx5和質粒載體pCAMBIA 3301分別用NcoI和BglⅡ雙酶切，分別回收PMD-Zm-Prx5目的片段和線性的質粒載體pCAMBIA 3301目的片段；兩個雙酶切產物經T4T4-DNA連接，構建成Zm-Prx5過表達載體，命名為pCAMBIA 3301-Zm-Prx5保存備用；

用pCAMBIA 3301-Zm-Prx5轉化S1的農桿菌感受態細胞，得到轉化菌；

將轉化菌導入到玉米幼胚培養的愈傷組織，后續進行篩選和誘導再生，獲得T0代轉基因材料。

7.根據權利要6所述的應用，其特征在于，種植T0代轉基因材料，在玉米5葉時，篩選出抗除草劑和具有Bar基因的陽性植株，陽性植株自交獲得T0代種子；種植獲得的T0代轉基因玉米株系，在玉米5葉時，篩選出抗除草劑和具有Bar基因的T0代陽性植株，T0代陽性植株自交得到T1代種子；篩選出抗除草劑和具有Bar基因的T1代陽性植株，T1代陽性植株自交得到T2代種子，種植T2代種子，篩選出抗除草劑和具有Bar基因的T2代陽性植株，T2代陽性植株為穩定性高的抗玉米莖腐病植株。

8.根據權利要6所述的應用，其特征在于，陽性克隆子的PCR反應體系如下：模板1μl、2×GC buffer I 12.5μl、dNTP 2.0μl、Zm-Prx5 F2 1.0μl、Zm-Prx5 R2 1.0μl、LA-Taq 0.3μl、ddH₂O 7.2μl；總體積25μl；

PCR反應程序如下：95℃預變性5min；95℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35個循環；72℃延伸10min；4℃forever。