[發明專利]一種具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針的制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201910071429.2
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109650387B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 張忠平;韓光梅;王振洋;趙君;劉正杰;劉變化;楊林林
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C01B32/198
• 分類號: C01B32/198;C12Q1/02
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

本發明公開了一種具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針的制備方法及其用途，是以導電炭黑顆粒為起始原料，首先經過硝酸氧化得到表面含羧基的氧化石墨烯，然后與氯化亞砜回流反應得到酰氯化中間體，再與過量二胺反應，得到表面含有氨基的氧化石墨烯，最后，通過酰胺化反應將帶正電的陽離子化合物修飾到氧化石墨烯表面，得到表面帶正電的氧化石墨烯，即所述具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針。本發明氧化石墨烯探針能夠穿透細胞膜、細胞核膜，進入到細胞核，而且能夠穿過層層的生物活體膜屏障，進入到活體生物生殖腺細胞內，實現對細胞及生物活體水平上核酸結構的同步標記及影像分析。

技術領域

本發明涉及氧化石墨烯納米材料合成及生物分子影像分析領域，具體涉及一種具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針的制備方法及其用途。

背景技術

核酸是由許多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，是生命的最基本物質之一。根據其化學組成及核苷酸排列順序的不同，可以分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質基礎，RNA在蛋白質合成過程中起著重要作用。因此，核酸在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現象中起決定性的作用。在活細胞中實時原位觀察DNA和RNA結構的動態變化，對深入理解細胞的轉錄、凋亡等生命活動以及揭示腫瘤發生、病毒感染、遺傳變異等疾病機理具有重要意義。

然而，由于細胞包含細胞膜及各種細胞器內膜等復雜膜結構，尤其是細胞核膜結構，其對核內外物質的交換具有高度的選擇性，能夠嚴格控制細胞核內外的物質運輸及信息交換，以維持遺傳信息的穩定性。因此，目前能用于細胞內DNA和RNA成像探針的并不多見。更重要的是，由于目前的DNA和RNA成像探針的局限性，在活細胞及生物活體中成功區分DNA和RNA，并實時動態的觀察其結構變化仍然是一項挑戰。首先，在DNA和RNA的結合染料中，只有少數的能夠穿透層層的細胞內膜屏障，而且幾乎沒有一種能夠直接穿透組織及器官屏障。其次，大多數的有機染料都有光漂白性，無法進行長時間的動態觀察，而且無法承受需要高激光能量的超高分辨掃描成像。最后，目前大多數的染料不能同步區分DNA和RNA，需要同時使用多種染料，甚至需要借助復雜昂貴的成像技術，如門控技術等，這雖然能部分的解決問題，但多染料的同時使用同時也造成了染料的輸送及生物分布的復雜化。

發明內容

本發明針對上述現有技術所存在的問題，提供了一種具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針的制備方法及其用途。本發明的氧化石墨烯探針具有高效生物膜穿透能力以及核酸高效識別能力，有效解決了現有DNA與RNA成像探針存在的活細胞及生物活體水平上膜穿透能力差、易光漂白、無法同步檢測等技術問題。

本發明具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針，是以導電炭黑顆粒為起始原料，首先經過硝酸氧化得到表面含羧基的氧化石墨烯，然后與氯化亞砜回流反應得到酰氯化中間體，再與過量二胺反應，得到表面含有氨基的氧化石墨烯，最后，通過酰胺化反應將帶正電的陽離子化合物修飾到氧化石墨烯表面，得到表面帶正電的氧化石墨烯，即所述具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探針。具體包括如下步驟：

步驟1：將商業化的導電炭黑顆粒0.2g(粒徑30nm)置于50mL、6M的硝酸中回流反應24小時，反應結束后冷卻至室溫，離心，收集上清液；所得上清液在180-200℃下蒸發除去溶劑，得到紅棕色固體，于真空干燥箱中干燥，得到表面含羧基的氧化石墨烯；硝酸氧化得到的羧基氧化石墨烯具有均一的小尺寸，粒徑尺寸＜10nm。

步驟2：向步驟1獲得的表面含羧基的氧化石墨烯中加入過量氯化亞砜，然后滴加幾滴無水DMF，攪拌溶解，回流反應，反應結束后蒸餾除去過量氯化亞砜，得到酰氯化中間體；本步驟中氯化亞砜做溶劑，DMF起助溶催化作用。

步驟3：向步驟2所得酰氯化中間體中加入二胺，并加入無水四氫呋喃作溶劑，60-80℃反應48-72小時，硅膠柱純化后得到表面含有氨基的氧化石墨烯；本步驟中二胺的添加量是酰氯化中間體的1.5-2倍當量。