[發(fā)明專利]一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910067345.1
• 申請(qǐng)日: 2019-01-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109511553A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 趙靜
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

1.一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

S1、無(wú)菌組培苗的獲得

選取生長(zhǎng)健壯的黃連植株，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗30min，在凈化工作臺(tái)中切取植株上帶芽莖段，用無(wú)菌水清洗2~3次，再用75%乙醇浸泡30~50s，無(wú)菌水洗去殘留，最后用0.2%升汞浸泡8~10min，無(wú)菌水洗去殘留；消毒后的莖段置于無(wú)菌濾紙上吸干表面的水分，然后接種到含有0.5mg/LNAA、0.1mg/L6-BA的MS固體培養(yǎng)基上，置于適宜條件下培養(yǎng)直到長(zhǎng)成具有真葉的無(wú)菌組培苗；

S2、外植體的預(yù)培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將黃連無(wú)菌組培苗的真葉剪下，切成大小約0.5cm²的小塊作為外植體接種到預(yù)培養(yǎng)基上，置于23~25℃、黑暗條件下培養(yǎng) 2~3d，培養(yǎng)期間每天于同一時(shí)間段對(duì)外植體依次進(jìn)行TDP輻照和 ⁶⁰Coγ射線輻照的雙重處理；

S3、發(fā)根農(nóng)桿菌的活化

將發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060的菌種劃線接種到Y(jié)EB 固體培養(yǎng)基上，置于28℃、黑暗條件下活化3次，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，置于28℃、200r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4℃下3500r/min離心10min收集菌體，并用MS液體培養(yǎng)基重懸、稀釋制成菌懸液；

S4、毛狀根的誘導(dǎo)與除菌

外植體預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至發(fā)根農(nóng)桿菌菌懸液中進(jìn)行真空輔助侵染15~20min，將外植體取出用無(wú)菌濾紙吸干表面多余的菌液，接種到共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3~4d，然后取出用無(wú)菌水沖洗后轉(zhuǎn)接到除菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每7d轉(zhuǎn)接一次，并逐漸降低除菌培養(yǎng)基中抗生素濃度，直到培養(yǎng)基上無(wú)菌落出現(xiàn)，再將長(zhǎng)度為2~3cm、生長(zhǎng)迅速的毛狀根單根切下轉(zhuǎn)接到新鮮的除菌培養(yǎng)基上，繼續(xù)進(jìn)行除菌培養(yǎng)，徹底去除發(fā)根農(nóng)桿菌；

S5、毛狀根的液體培養(yǎng)

將徹底除菌的毛狀根接種到1/2MS液體培養(yǎng)基中，置于21~23℃、800~1000lx散射光照的條件下連續(xù)培養(yǎng)，每20d左右繼代一次，獲得大量生長(zhǎng)的毛狀根；

S6、毛狀根的PCR檢測(cè)

采用CTAB法提取黃連無(wú)菌組培苗總DNA作為陰性對(duì)照，同法提取上述毛狀根總DNA作為檢測(cè)模板，采用堿解法提取發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒 DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)目的基因?yàn)?Italic>rolB，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟S1中適宜條件是指溫度21~23℃，光照強(qiáng)度1500~2000lx，光照時(shí)間12~14h/d。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟S2中預(yù)培養(yǎng)基的成分為：MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/L ZT+150μmol/L茉莉酸甲酯+100μmol/L乙酰丁香酮+3.5g/L植物凝膠。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟S2中TDP輻照處理的參數(shù)為：輻照距離45cm，輻照時(shí)間35min，溫度控制在30℃；⁶⁰Coγ射線輻照處理的參數(shù)為：輻照劑量50Gy，劑量率1.84Gy/min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟S3中菌懸液的濃度為：菌懸液OD₆₀₀值為0.5~0.7，優(yōu)選為0.6。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃連毛狀根的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟S4中真空輔助侵染的方法為：將裝有外植體和發(fā)根農(nóng)桿菌菌懸液的三角瓶置于真空干燥器內(nèi)，用無(wú)油活塞真空泵抽去空氣形成0.08MPa的真空度。