[發明專利]提升馬鈴薯PSTVd抗性的amiRNA及其應用

在審

• 申請號: 201910066125.7
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN110684766A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 呂典秋;劉尚武;郭惠珊;房媛媛;趙建華;宿飛飛;李輝
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 50247 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 王貴君

本發明公開了提升馬鈴薯PSTVd抗性的amiRNA及其應用，amiRNA的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，利用表達小RNA的策略，表達人工miRNA，獲得具有較好的抗PSTVd效果的轉基因馬鈴薯，且與野生型馬鈴薯在生物學表型上沒有明顯的差異，該方法不需要長的病源cDNA片段，有效的小RNA不會被大量由長cDNA片段產生的無效的小RNA所稀釋，沒有同源性的人工miRNA序列可以避免“脫靶”，不會造成植物發育缺陷；還可以可以避免長片段RNA同源互補對農業生產應用中帶來的生物安全問題；并且也可以為其他作物的轉基因抗病育種工作提供一些理論借鑒，促進我國作物分子抗病育種研究的發展。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及提升馬鈴薯PSTVd抗性的amiRNA，還涉及提升馬鈴薯PSTVd抗性的amiRNA的應用。

背景技術

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是影響馬鈴薯種薯質量的重要病害。該病害能夠隨著種薯的無性繁殖逐代傳播，而且隨著帶毒代數的增加，癥狀越來越重，產量急劇降低，塊莖變小，龜裂、畸形，基本失去商品性，更無種用價值。

國內外解決馬鈴薯種薯退化的主要方式是通過莖尖剝離、組織培養方式進行汰除病毒，建立脫毒種薯繁育體系，生產健康種薯。但存在以下問題，在眾多的病原菌中，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病不同于病毒，是沒有蛋白外殼的裸露的亞病毒，是不能通過莖尖剝離、組織培養來汰除，一旦發現就只能淘汰，無法實現脫毒。

PSTVd可進入細胞核是由于類病毒序列或結構區域與細胞內運輸因子相互作用，形成核酸-蛋白復合物，這個復合物將協助類病毒進入細胞核內。有研究表明，植物的轉錄因子類病毒結合蛋白1(VIRP 1)能被類病毒利用，協助類病毒在植物體內的復制和系統傳播。這個類病毒結合蛋白是從RNA配體篩選過程中分離出來的，這個蛋白與正鏈PSTVd RNA相互作用，它是與染色體修復相關的轉錄調節因子家族中的一員。Virp 1含有核定位信號，可以進出細胞核，是PSTVd(和其它相關類病毒)進出細胞核的載體；在馬鈴薯中找到了與VIRP1蛋白同源的馬鈴薯基因brp基因。

隨著現代分子生物技術的發展，分子育種技術逐漸應用在植物抗病毒方面，自l983年世界上誕生了第l例轉基因植物以來(Deblock et al，1984)，植物基因工程技術已取得了突飛猛進的發展，為病毒病的防治和抗病育種工作開辟了新的途徑，許多具有重要經濟價值的轉基因作物已經開始陸續進入實際應用階段。目前植物抗病毒基因工程的策略主要包括3個：第一個策略是利用病毒本身的基因導入受體植物以獲得抗性植株，所獲得的抗性也稱病原起源的抗性；第二、三個策略是分別利用植物中自然存在的抗性基因和植物、微生物的核糖體失活蛋白(RIPs)基因以及多基因策略獲得抗病毒植物(Kalantidis etal，2008)。