[發(fā)明專利]一種檢測KRAS基因外顯子2密碼子12/13突變的試劑盒及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910065629.7
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109593856A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋現(xiàn)讓;宋興國;謝麗
• 申請（專利權(quán)）人: 宋現(xiàn)讓
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測KRAS外顯子2密碼子12/13突變的試劑盒，其特征在于，包括： PCR 擴(kuò)增引物， Taq-man探針，數(shù)字PCR預(yù)混液、微滴生成油、陰性對照和陽性對照；

所述的PCR 擴(kuò)增引物，包括反向PCR 擴(kuò)增引物和正向PCR 擴(kuò)增引物，可擴(kuò)增含有KRAS外顯子2上c.5522-c.5637 (116-bp amplicon)序列如SEQ No.1所示；

所述的PCR擴(kuò)增引物序列如下：

上游引物序列如SEQ No.2所示；

下游引物序列如SEQ No.3所示；

參考探針序列如SEQ No.4所示；

位點(diǎn)探針序列如SEQ No.5所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的位點(diǎn)探針及參考探針的5’端連接有熒光基團(tuán)，3’端連接有猝滅基團(tuán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光基團(tuán)選自6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；

所述的猝滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的數(shù)字PCR預(yù)混液主要成分包含TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用濃度為5 μM~15 μM，在最終反應(yīng)體系中的濃度為400 nM~1200 nM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的位點(diǎn)探針和參考探針的使用濃度為5 μM~25 μM，在最終反應(yīng)體系中的濃度為100 nM~500 nM。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照來源于攜帶KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975；陽性對照來源于攜帶KRAS基因2外顯子密碼子12/13突變的陽性細(xì)胞人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480或HCT-116。

8.一種權(quán)利要求所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）DNA提?。禾崛『蠯RAS基因2外顯子密碼子12/13突變的陽性細(xì)胞人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480或HCT-116和KRAS基因野生型細(xì)胞H1975；

（2）數(shù)字PCR反應(yīng)液制備；

（3）PCR反應(yīng)微滴制備：將PCR反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡，在油孔中加入微滴生成油，制備微滴；

（4）PCR擴(kuò)增：退火后，然后擴(kuò)增反應(yīng)；

（5）檢測及計(jì)算突變率。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）包括：將待檢測樣品、PCR擴(kuò)增上下游引物、無酶水、KRAS基因2外顯子密碼子12/13突變的位點(diǎn)探針和參考探針以及數(shù)字PCR預(yù)混液混合混合制備得到數(shù)字PCR混合液。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（4）的擴(kuò)增反應(yīng)過程為：93～97℃預(yù)變性3～15分鐘；93～97℃變性5～50秒，55℃～63℃退火/延伸60～120秒，，共進(jìn)行20～60個循環(huán)，95℃～100℃酶失活8～16分鐘，16℃無限循環(huán)。