[發(fā)明專利]冠狀病毒抗性克隆豬及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910062079.3
• 申請日: 2019-01-23
• 公開（公告）號: CN109628494A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊化強(qiáng);張健;石俊松;吳珍芳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué);溫氏食品集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務(wù)所 44275
• 代理人: 張明

本發(fā)明涉及一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的冠狀病毒抗性克隆豬及其制備方法，該克隆豬的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)獲取特異性靶向pAPN基因第2外顯子和第3外顯子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1?2所示；制備獲得對應(yīng)gRNA序列的CRISPR?Cas9打靶載體PX330?pAPN2和PX330?pAPN3；(2)將獲得的打靶載體PX330?pAPN2或打靶載體PX330?pAPN3轉(zhuǎn)入豬胎兒成纖維細(xì)胞中，獲得pAPN基因編輯細(xì)胞系；(3)對pAPN基因編輯細(xì)胞系進(jìn)行體細(xì)胞核移植操作，并將重構(gòu)胚胎移植入代孕受體，通過自然妊娠出生所述克隆豬。本發(fā)明可獲得豬冠狀病毒受體pAPN完全缺失表達(dá)的克隆豬，具有抵抗豬冠狀病毒感染的能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因技術(shù)，特別涉及一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的冠狀病毒抗性克隆豬及其制備方法。

背景技術(shù)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR-associated protein(Cas)9系統(tǒng)是原核生物的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用來抵御噬菌體及外源遺傳物質(zhì)侵入。近年來，研究者通過改造該系統(tǒng)使其可適用于哺乳動物的細(xì)胞與體內(nèi)。該系統(tǒng)通過一條與目的DNA位點(diǎn)序列一致的guide RNA(gRNA)進(jìn)行引導(dǎo)，從而介導(dǎo)Cas9蛋白對目的位點(diǎn)進(jìn)行特異性地切割，從而形成DNA雙鏈斷裂。而基因組上的雙鏈斷裂可以顯著提升后續(xù)的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knockin)的效率，從而可以高效地對目的位點(diǎn)進(jìn)行修飾操作，從而達(dá)到缺失目的基因表達(dá)表達(dá)，或賦予目的基因以新的功能。CRISPR/Cas9當(dāng)前已在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域都得到了廣泛而深入的應(yīng)用，幾乎可以對任何物種的任意基因片段進(jìn)行隨心所欲的編輯。

冠狀病毒(Coronavirus)是一類影響?zhàn)B豬業(yè)的重要病毒，主要引起豬腹瀉和呼吸系統(tǒng)疾病，尤其對仔豬具有較高致死率。當(dāng)前主要流行的豬冠狀病毒包括流行性腸胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)、豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratorycoronavirus，PRCV)和丁型冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)等。這其中尤以PEDV最為嚴(yán)重，其近年來廣泛流行、常態(tài)爆發(fā)，對哺乳期仔豬的致死率可達(dá)95％以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。此類病毒的疫苗防控較為困難，對仔豬的被動乳汁免疫是主要途徑，其防控效果尚不夠明確；且毒株變異的加快也造成疫苗防控的滯后與無效。

前期的研究發(fā)現(xiàn)豬氨肽酶N(Pig Aminopeptidase N，pAPN)是多種冠狀病毒的細(xì)胞受體，包括TGEV、PRCV、PDCoV等，PEDV感染宿主的受體也可能為pAPN，但尚存在爭議。細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)冠狀病毒非敏感細(xì)胞導(dǎo)入表達(dá)pAPN后可以變?yōu)楣跔畈《镜拿舾屑?xì)胞；而阻斷冠狀病毒與pAPN的結(jié)合可以抑制其對宿主細(xì)胞的感染。因此如能缺失豬體內(nèi)pAPN基因的表達(dá)，將會阻斷多種冠狀病毒對豬的感染。培育該種受體缺失豬對養(yǎng)豬業(yè)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的冠狀病毒抗性克隆豬，通過將豬冠狀病毒受體pAPN基因敲除，完全缺失豬體內(nèi)pAPN蛋白的表達(dá)，從而具有抵抗豬冠狀病毒感染的能力；

基于上述，本發(fā)明還提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的冠狀病毒抗性克隆豬的制備方法，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的定點(diǎn)打靶技術(shù)對pAPN基因進(jìn)行移碼突變，從而獲得pAPN基因敲除的克隆豬。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的冠狀病毒抗性克隆豬的制備方法，包括以下步驟：