[發(fā)明專利]一種快速鑒別覆盆子及其多種混淆品的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910062042.0
• 申請日: 2019-01-23
• 公開（公告）號: CN109762919B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭昕;袁莉霞;陳宏降;王志安
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京君恒知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11466
• 代理人: 鄭黎明

1.一種快速鑒別覆盆子及其多種混淆品的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一：提取覆盆子及其多種混淆品的DNA，其中混淆品包括周毛懸鉤子、木莓、寒莓、蓬蘽、茅莓、高粱泡、太平莓、樹莓、插田泡；步驟二：PCR擴(kuò)增：首先選取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制備25微升反應(yīng)體系：加入10×PCR緩沖液，25毫摩爾/升鎂離子，10毫摩爾/升dNTP，5單位/微升Taq酶，20微摩爾/升引物，模板DNA和雙蒸水混勻，而后在95℃預(yù)變性5分鐘后變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘，得到的PCR擴(kuò)增的基因片段大小為700～750bp，再對反應(yīng)后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢查；步驟三：用PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，采用雙向測序測定核苷酸序列，先后用不同引物測定覆盆子及其多種混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多個(gè)DNA序列，經(jīng)序列分析，覆盆子樣品序列具有限制性內(nèi)切酶DpnII或MboI的識別位點(diǎn)，識別序列為/gatc；步驟四：在滅菌離心管中加入PCR產(chǎn)物，10×緩沖液，滅菌超純水，限制性內(nèi)切酶DpnII或MboI進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘；步驟五：取適量的酶切反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，在電壓為120V下，電泳40分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠用溴化乙錠染色，若樣品出現(xiàn)171bp+545bp二條帶，則供試樣品為覆盆子，若不具有171bp+545bp二條帶，則供試品非覆盆子來源或混雜有其他混淆品，從而可快速鑒別判斷藥材覆盆子的真?zhèn)渭笆欠駬饺肓嘶煜?；此后，鑒別覆盆子及其多種混淆品只需重復(fù)步驟一、二、四、五。

2.如權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別覆盆子及其多種混淆品的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量檢查：取DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在120V電壓下電泳，電泳結(jié)束后將凝膠用溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測DNA條帶。

3.如權(quán)利要求1所述的一種快速鑒別覆盆子及其多種混淆品的方法，其特征在于，所述的10×緩沖液的組成為：10毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，100毫摩爾/升氯化鉀，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸，0.2毫克/毫升牛血清白蛋白，50％甘油。

4.一種快速鑒別覆盆子及其多種混淆品的方法，其特征在于，包括以下：步驟一：提取覆盆子及其多種混淆品的DNA，其中混淆品包括周毛懸鉤子、木莓、寒莓、蓬蘽、茅莓、高粱泡、太平莓、樹莓、插田泡；步驟二：PCR擴(kuò)增：首先選取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制備25微升反應(yīng)體系：加入10×PCR緩沖液，25毫摩爾/升鎂離子，10毫摩爾/升dNTP，5單位/微升Taq酶，20微摩爾/升引物制備預(yù)混液， 最后加入模板DNA和雙蒸水進(jìn)行充分混勻，而后在92℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘，得到的PCR擴(kuò)增的基因片段大小為700～750bp，再對反應(yīng)后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢查；步驟三：用PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，采用雙向測序測定核苷酸序列，先后用不同引物測定覆盆子及其多種混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多個(gè)DNA序列，經(jīng)序列分析，覆盆子樣品序列具有限制性內(nèi)切酶DpnII或MboI的識別位點(diǎn)，識別序列為/gatc；步驟四：在滅菌離心管中加入PCR產(chǎn)物，10×緩沖液，滅菌超純水，限制性內(nèi)切酶DpnII或MboI進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘；步驟五：取適量的酶切反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，在電壓為120V下，電泳40分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠用溴化乙錠染色，若樣品出現(xiàn)171bp+545bp二條帶，則供試樣品為覆盆子，若不具有171bp+545bp二條帶，則供試品非覆盆子來源或混雜有其他混淆品，從而可快速鑒別判斷藥材覆盆子的真?zhèn)渭笆欠駬饺肓嘶煜?；此后，鑒別覆盆子及其多種混淆品只需重復(fù)步驟一、二、四、五。