[發明專利]一種用于篩選噬菌體的前處理方法

有效

• 申請號: 201910061904.8
• 申請日: 2019-01-23
• 公開（公告）號: CN109750026B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 張建城;王林會
• 申請（專利權）人: 艾美漢信疫苗（大連）有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10;C12N11/089;C12N7/00;C12Q1/70;C12R1/92
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 王廉

本發明公開一種用于篩選噬菌體的前處理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：首先，向處于生長對數期的目標菌株發酵液中按照一定的質量百分比添加海藻酸鈉、聚二甲基硅氧烷、低聚異麥芽糖和鈉基膨潤土，攪拌混勻至完全溶解，然后，利用滴液發生器將上述溶液滴至氯化鈣溶液中形成微球，回收微球并將其置于真空冷凍干燥機中干燥，將凍干微球置于噬菌體分離原液中孵育，同時使用磁力攪拌器保持噬菌體分離原液的流動性，回收微球，并將微球置于研缽中，向研缽中加入PBS溶液，研磨至微球溶解在PBS溶液中，將溶解后的溶液過0.22微米孔徑濾膜，收集濾過液，濾過液即為為目標菌株的噬菌體富集液。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種用于篩選噬菌體的前處理方法。

背景技術

噬菌體（Bacteriophage）是一類寄生于細菌、霉形體、螺旋體、放線菌以及藍細菌等病毒，亦稱細菌病毒。在自然界分布極廣，凡是有上述各類微生物的地方，都有相應種類噬菌體的存在，其數目與寄主的數量成正比。噬菌體是1915年Frederick W. Twort及1917年Felix d’Herelle 分別發現的，曾被稱為Twort-d’Herelle現象，之后，國外的研究者進行了探索性研究工作。二十世紀四十年代抗生素的迅速發展，有關噬菌體治療方面的研究基本處于停滯狀態。直到二十世紀末，基于抗生素的濫用而產生耐藥菌株和藥物殘留等問題日益加重，噬菌體的治療技術又重新受到人們的重視。

噬菌體能與宿主發生特異性結合并注入其DNA，如能發生增殖并使宿主細菌迅速裂解引起溶菌反應的噬菌體，稱為裂解性或毒性噬菌體；與細菌DNA同步復制，并隨細菌的分裂而傳給后代，不會導致細菌裂解，但在外界條件的刺激下，可從宿主DNA中剪接出來，利用宿主細胞內的酶系和蛋白進行自我復制，引起溶菌反應而釋放出噬菌體，稱為溶源性噬菌體。由于溶源性細菌能抵抗相應烈性噬菌體的溶菌作用，不適合用與持續的噬菌體治療，所以噬菌體治療必須選用烈性噬菌體。裂解性噬菌體在溶解其特異性宿主細菌時十分有效，而且其殺死細菌的機制與抗生素不同，已成為目前抗生素替代品中的研究熱點。

目前，噬菌體的篩選工作已經成為噬菌體領域發展的瓶頸問題，特別是對于一些稀有的特殊目標菌株如古細菌、極端條件菌株等，噬菌體的篩選工作異常艱難。另外，噬菌體的篩選效率決定了噬菌體制劑的研發效率，是一款噬菌體制劑有效性的決定因素。現在最常用的噬菌體篩選方案是通過將采集的噬菌體分離原液直接與處于對數生長期的菌液進行混合，使樣品中的噬菌體顆粒與其目標菌株結合后進入噬菌體繁殖復制周期，從而達到富集噬菌體的目的。然而，應用該方法進行篩選時，常常由于受到噬菌體分離液體積的限制，無法同時進行多株宿主菌的噬菌體篩選工作。同時，如果降低單次富集的噬菌體分離液的體積則會大大降低噬菌體顆粒與宿主菌接觸的概率，降低篩出率。因此，為了滿足噬菌體制劑研發過程中大規模高效率的噬菌體篩選工作，亟需一種高通量的噬菌體篩選方案，在不降低篩出率的前提下，提高噬菌體分離液的利用效率，從而提高噬菌體的篩選通量。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種可大大提高噬菌體篩選的通量，提高噬菌體分離原液的利用率，縮短研發周期，加快篩選進程的處理方法。

本發明的技術解決方案是：一種用于篩選噬菌體的前處理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：

首先，向處于生長對數期的目標菌株發酵液中按照質量百分比添加1~1.5%的海藻酸鈉、0.1~0.5%的聚二甲基硅氧烷、1~2%的低聚異麥芽糖和1~5%的鈉基膨潤土，其中鈉基膨潤土的蒙脫石含量≥85%，攪拌混勻至完全溶解，

然后，利用滴液發生器將上述溶液滴至1~2%（w/w）的氯化鈣溶液中形成微球，并保持微球粒徑大小在3~5 mm，從氯化鈣溶液中回收微球并將其置于真空冷凍干燥機中，干燥至含水量低于1%，

將凍干微球置于噬菌體分離原液中，凍干微球與噬菌體分離原液的質量體積比為1:1g/ml，在28~37℃的條件下孵育12小時，同時使用磁力攪拌器保持噬菌體分離原液的流動性，