[發(fā)明專利]基于破壞革蘭氏陰性菌外膜蛋白組裝復(fù)合物BAM的抗菌多肽

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910060029.1
• 申請(qǐng)日: 2019-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN109734812B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付新苗;程宇;周耀琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;A61K38/16;A61K38/08;A61P31/04
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發(fā)明公開了基于破壞革蘭氏陰性菌外膜蛋白組裝復(fù)合物BAM的抗菌多肽，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，分別命名為BamA?h7，BamD?h7；或者所述抗菌多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少70%的同源性。在BamA?h7或BamD?h7的氨基端融合上能特異性穿透細(xì)胞膜的導(dǎo)肽，導(dǎo)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，融合多肽BamA?h7的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；融合多肽BamD?h7的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩段多肽的前端偶聯(lián)上能特異性穿透細(xì)胞膜的導(dǎo)肽，融合后能直接進(jìn)行殺菌。本發(fā)明提供的兩種多肽以及含有導(dǎo)肽的兩種融合多肽都具有優(yōu)異的殺菌性能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于破壞革蘭氏陰性菌外膜蛋白組裝復(fù)合物BAM的抗菌多肽。

背景技術(shù)

自青霉素的問世到如今，抗生素一直以來都是人類對(duì)抗細(xì)菌感染疾病的首選藥物。但幾十年以來，臨床抗生素的頻繁使用以及各種抗生素的不正常使用導(dǎo)致全球范圍內(nèi)耐藥菌出現(xiàn)的頻率大大增加，而每年死于耐藥細(xì)菌感染的人數(shù)也在持續(xù)的增加。

陽(yáng)離子抗菌肽是自然界天然進(jìn)化而成、具有抗致病微生物感染的生物活性大分子，存在于不同物種的免疫系統(tǒng)內(nèi)，長(zhǎng)度較短一般為10-80個(gè)氨基酸。其結(jié)構(gòu)特征為：①攜帶正電荷，富含堿性氨基酸，此特性被認(rèn)為是與抗菌肽結(jié)合攜帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。②二級(jí)結(jié)構(gòu)通常為α螺旋結(jié)構(gòu)。③具有兩親性。陽(yáng)離子抗菌肽可以通過與細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)特異性結(jié)合來對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生影響最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。而細(xì)菌較難通過靶點(diǎn)的突變對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥，因此抗菌肽有希望成為臨床治療重癥耐藥細(xì)菌感染的新型抗生素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供基于破壞革蘭氏陰性菌外膜蛋白組裝復(fù)合物BAM的抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或者其氨基酸序列與SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少70%的同源性。

本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌中諸多外膜蛋白都需要通過外膜上的BAM桶蛋白折疊系統(tǒng)來完成修飾和安插到外膜上正確位置的機(jī)制，根據(jù)文獻(xiàn)《 Structural basis of outermembrane protein insertion by the BAM complex》中對(duì)BAM桶蛋白系統(tǒng)的介紹得知該蛋白系統(tǒng)有五個(gè)蛋白質(zhì)亞基分別為A、B、C、D、E且該系統(tǒng)具有兩種構(gòu)型BamABCDE和BamACDE，而在兩種構(gòu)型中BamA和BamD為必不可少的蛋白質(zhì)亞基，針對(duì)這兩種蛋白質(zhì)亞基設(shè)計(jì)了七種能與之結(jié)合的特異性多肽，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來測(cè)試在干擾了相對(duì)應(yīng)的蛋白亞基情況下是否會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)存活產(chǎn)生影響。在最后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)有兩種短肽具有顯著的殺菌效果，分別簡(jiǎn)稱BamA-h7（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）和BamD-h7（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。

本發(fā)明中的兩種多肽都是對(duì)耐藥細(xì)菌具有較高抑制活性的多肽，而且兩種多肽長(zhǎng)度比較短，全長(zhǎng)分別為9個(gè)氨基酸和25個(gè)氨基酸，大大的降低了合成的成本。兩種多肽的全序列分別為：BamA-h7：纈氨酸-丙氨酸-甲硫氨酸-色氨酸-精氨酸-酪氨酸-亮氨酸-酪氨酸-絲氨（VAMWRYLYS）。BamD-h7：丙氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-精氨酸-亮氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-精氨酸-亮氨酸-丙氨酸-賴氨酸-酪氨酸-谷氨酸-酪氨酸-絲氨酸-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-谷氨酸（ATKRLVFLKDRLAKYEYSVAEYYTE）。

體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的兩種多肽在通過處理進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后可以對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)出良好的殺菌效果。殺菌曲線結(jié)果表明，BamA-h7在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)能殺滅99.9%實(shí)驗(yàn)菌株，直到8小時(shí)候才有所恢復(fù)。而BamD-h7同樣能在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)殺滅大部分細(xì)菌，但恢復(fù)時(shí)間則為4小時(shí)。所述的實(shí)驗(yàn)菌株為革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌。