[發明專利]用于甄別半滑舌鰨真偽雄魚性的熒光分子標記和檢測方法

有效

• 申請號: 201910059851.6
• 申請日: 2019-01-22
• 公開（公告）號: CN109536624B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 張博;傅延;趙娜;劉洋洋;賈磊;徐子靜
• 申請（專利權）人: 天津渤海水產研究所;安徽微分基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12N15/11
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本發明為用于甄別半滑舌鰨真偽雄魚性的熒光分子標記和方法。分子標記的設計和檢測是基于五引物擴增阻礙突變體系（即PARMS，Penta?primer amplification refractory mutation system)。利用半滑舌鰨Z/W性染色體DNA序列差異確認了Z/W性染色體間DNA序列上的SNP位點（命名為SNP_chr_8935925_C_T）。對60條性別已知樣本的高通量qPCR實驗驗證表明該分子標記可成功鑒定所有樣本中的真偽雄魚。該標記和相應的檢測方法在保證準確率的前提下，使操作更快捷，成本更低廉，檢出率更高，并可實現高通量檢測。

技術領域

本發明屬于水產生物技術中的海水魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術領域，是一種基于半滑舌鰨性染色體Z/W之間的SNP位點開發出來的能甄別其性別的共顯性高通量熒光分子標記。

背景技術

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，是我國海域特有的一種暖溫性近海大型底層魚類，主要分布于以黃海、渤海的沿岸地區。由于半滑舌鰨自然資源量少，味鮮鮮美，口感爽滑，營養豐富，因此具有廣闊的養殖前景，是重要的名貴海水養殖魚類。半滑舌鰨作為比目魚，雌性個體的生長速率是雄性個體的3倍以上(陳松林等，2013)，而雄魚具有生長緩慢、個體體型小的特點，降低了半滑舌鰨的養殖產量，同時使養殖成本增加。半滑舌鰨養成中雄魚甚至可以達到80％—90％。研究發現在80％—90％比例的雄魚中有一部分是偽雄魚。有研究表明半滑舌鰨性別決定機制為性染色體Z和W，其中同型染色體ZZ為遺傳雄性個體，異型染色體ZW型為遺傳雌性個體(Zhuang et al.,2006；周麗青等,2005)。半滑舌鰨正常雄魚具有ZZ型的染色體，正常雌魚具有ZW型的染色體。而偽雄魚遺傳的是雌性染色體，基因型都是ZW型。但從其體貌特征和生殖器官上均表現為雄性特征，也可以像雄魚一樣產生可育精子和繁育后代。而且如果用偽雄魚作為父本，那么后代也會遺傳父本的特征成為偽雄魚。這樣通過逐代積累，就導致了半滑舌鰨養殖群體中生理雌性的比例的失衡(即雄魚越來越多，雌魚越來越少)，從而嚴重影響半滑舌鰨養殖產量。因此，對快速鑒定半滑舌鰨性別尤其是真偽雄魚甄別的高效分子標記和檢測方法的開發，對其遺傳性別鑒定及生產養殖，具有重要的科學意義和應用價值。

在半滑舌鰨性別特異分子標記篩選和遺傳性別鑒定方面，前人通過AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)標記技術分離到半滑舌鰨雌性特異AFLP標記(Chen et al.，2007)，由于AFLP標記是顯性遺傳，應用中不能區分ZW雌性和WW超雌個體，難以避免假陰性的結果，從而對ZZ雄魚和ZW雌魚產生誤判。通過對半滑舌鰨共顯性性別特異微衛星scaffold68-2標記篩選(劉洋等，2014)，可針對共顯性性別特異標記位點設計引物對半滑舌鰨遺傳性別進行鑒定，但實際應用中微衛星內INDEL短(小于50bp)，導致來自Z染色體和W染色體的兩種PCR擴增產物片段長度差異較小，對在凝膠電泳判定其長短時造成不小的困難。同時該技術檢測中需用濃度為4％的瓊脂糖凝膠以助于區分小的長度差異的條帶(如小于50bp)，而高濃度的瓊脂糖又不易配制、電泳用時長、費用高等問題，這都進一步限制了該方法的推廣。

因此，發明一種基于SNP的共顯性能甄別半滑舌鰨性別包括真偽雄魚的熒光分子標記來解決上述問題尤為必要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于甄別半滑舌鰨真偽雄魚性的熒光分子標記和檢測方法，利用半滑舌鰨性別特異性SNP位點分型，來解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案，包括以下步驟：

步驟一：下載已公開無知識產權的公用ZW染色體基因組序列；

步驟二：在尋找到的ZW染色體同源等位基因序列進行比對分析，篩選出能區分ZW性染色體的候選SNP位點；