[發明專利]一種黑素瘤納米抗體庫的構建方法

在審

• 申請號: 201910058785.0
• 申請日: 2019-01-22
• 公開（公告）號: CN109722716A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 董常生;姬凱元;范瑞文;齊淑慧;劉博
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C07K16/30;C12N15/13;C12N15/63
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種黑素瘤納米抗體庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)黑色素瘤細胞B16培養到80％豐度，破碎細胞，得到抗原共合物；

2)將步驟1)得到的抗原共和物與佐劑按體積比為1:1進行配制，將得到的配制物乳化后按200ug/次分點皮下免疫羊駝四次，每次間隔兩周，第一次免疫時，所述佐劑為完全弗氏佐劑，第二至第四次免疫時，所述佐劑為不完全弗氏佐劑；

3)第4次免疫后1周采集50ml羊駝抗凝血液，分離得到淋巴細胞，提取淋巴細胞總RNA，將所述RNA反轉錄為cDNA；

4)以步驟3)得到的cDNA為模版，用Call001-F和Call002-R引物進行第一輪PCR擴增，分離純化700bp的擴增產物；

所述Call001-F引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述Call002-R引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

5)以步驟4)得到的700bp的擴增產物為模版，用VHH2-F和VHH2-R引物PCR擴增VHH片段，分離純化VHH片段；

所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

6)將步驟5)得到的VHH片段和pCANTAB5e分別用SfiI酶進行兩次酶切，連接酶連接，構建得到pCANTAB5e-VHH重組表達載體；

7)將pCANTAB5e-VHH重組表達載體電轉化到TG1感受態細胞，得到黑素瘤納米抗體庫。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟1)培養使用的培養基為含有體積分數為8～12％FBS的DMEM高糖培養基。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟3)反轉錄包括：將5μg總RNA、1μl Random6 Primer、1μl Oligo(dT)₁₈ Primer、1μl dNTP Mix和7μl ddH₂O混合后在65℃下處理5min，將得到的處理物在冰上靜置5min，將所述靜置物與4μl 5X PrimeScript IIbuffer、0.5μl RNase inhibiter、1μl Primer Scrip II Reverse Transcriptase和4.5μlddH₂O混合后，依次40℃處理40min和70℃處理15min，得到cDNA。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟4)第一PCR擴增的體系每50μl包括：2μl cDNA、濃度為10umol/μl的Call001-F 1μl、濃度為10umol/ul的Call001-R 1μl、25μl Taq Green PCR Mix和21μl ddH₂O。

5.根據權利要求1或4所述的構建方法，其特征在于，所述步驟4)第一輪PCR擴增的程序包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30個循環；72℃5min。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟5)PCR擴增VHH片段的體系每50μl包括：濃度為800μg/μl的700bp擴增產物6μl、濃度為10μmol/ul的VHH2-F 2μl、濃度為10μmol/ul的VHH2-R 2μl、Taq GreenPCRMix 25μl和ddH₂O 15μl。

7.根據權利要求1或6所述的構建方法，其特征在于，所述步驟5)PCR擴增VHH片段的程序包括：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟6)連接的體系每200μl包括：VHH片段1μg、pCANTAB5e載體3μg、T4 DNA Ligase 10μl、10×Buffer 20μl，ddH₂O補充至200μl。

9.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟7)電轉化包括：所述電轉化的電壓為1.5～2.0KV，所述電轉化的電阻為180～220Ω，所述電轉化的電容為20～30μF，所述電轉化的時間為4～6ms。