[發(fā)明專利]鑒別長梗黃精和多花黃精的特征序列、引物及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910058166.1
• 申請日: 2019-01-22
• 公開（公告）號: CN109762918B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋其巖;李海波;葉碧歡;廖榮俊;翁永發(fā);李楠
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院;衢州市林業(yè)技術(shù)推廣站
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.鑒別長梗黃精和多花黃精的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下：

上游引物CG_Fb：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGAT-3′，

下游引物CG_Rb：5′-AAACCGGTAGCCTTGAACG-3′。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物對長梗黃精和多花黃精進(jìn)行快速區(qū)分的方法，所述方法為：提取待測黃精樣本的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)518 bp的DNA條帶，則待測黃精樣品為長梗黃精，若電泳結(jié)果未出現(xiàn)518 bp的DNA條帶，則待測黃精樣品為多花黃精；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為：

上游引物CG_Fb：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGAT-3′，

下游引物CG_Rb：5′-AAACCGGTAGCCTTGAACG-3′；

所述PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性6 min后；94℃變性30 s，55.7℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平7 min，終止溫度為4℃。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）取待測黃精樣品塊莖洗凈，切片，硅膠干燥，取適量加液氮磨碎，提取待測黃精樣本塊莖的基因組DNA；

（2）對步驟（1）獲得的樣品基因組DNA進(jìn)行核酸純度及濃度的檢測，OD₂₆₀/OD₂₈₀1.8的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增，并稀釋基因組DNA濃度為20 ng/μL用于后續(xù)檢測；

（3）以步驟（2）稀釋的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

PCR反應(yīng)體系每20 μL組成如下：

2×Power Taq PCR Master Mix 10 μL，

10 μM上、下游引物 各1.5 μL，

20 ng/μL模板DNA 3 μL，

ddH₂O補(bǔ)足至20 μL；

PCR反應(yīng)條件如下：

94℃預(yù)變性6 min后；94℃變性30 s，55.7℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平7 min，終止溫度為4℃；

（4）取步驟（3）擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中電泳40min，后于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相；若電泳結(jié)果出現(xiàn)518 bp的DNA條帶，則待測樣品為長梗黃精，若電泳結(jié)果未出現(xiàn)518 bp的DNA條帶，則待測黃精樣品為多花黃精。