[發明專利]一種檢測多個樣品時測序文庫的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201910056472.1
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109797437A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 周騁
• 申請（專利權）人: 北京愛普益生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 孫進華;吳林

本發明公開了一種檢測多個樣品時測序文庫的構建方法及其應用，該構建方法包括：步驟一、根據基因組DNA序列分別設計上游引物和下游引物；步驟二、在每條上游引物上添加A接頭和第一標簽，得到上游融合引物，在每條下游引物上添加P接頭和第二標簽，得到下游融合引物，并將上游融合引物與下游融合引物混合得到混合融合引物；步驟三、將混合融合引物、基因組DNA、含有Mg²⁺，dNTPs，Taq酶的Tris?HCl緩沖液和無核酸酶水配制成多重PCR反應體系；步驟四、將得到的多重PCR反應體系進行PCR反應、純化得到多樣品測序文庫；本發明構建方法通過上下游引物上不同標簽組合識別樣品，能夠大大降低引物合成量，此外，還能夠減少擴增次數，有效降低樣品間的數據不均衡。

技術領域

本發明涉及生物醫學、法醫學、刑偵及物證鑒定技術領域，具體涉及一種檢測多個樣品時測序文庫的構建方法及其應用。

背景技術

高通量測序技術自2010年以來發展迅猛，由于該技術可獲得的數據量較大，針對不同的項目需求，可滿足幾十甚至幾百份樣品的位點分型要求。為了區分樣品，在構建文庫時，每個樣品的序列前添加了樣品標簽(barcode)，在進行數據分析時利用識別序列將測序數據分到每個樣品中。

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個核苷酸堿基的改變而導致的核酸序列的多態性。目前，基于高通量測序技術檢測人基因組單核苷酸多態性中，測序數據的歸類均是通過單個樣品標簽進行識別；對于同時檢測幾十份樣品的上百個靶標的核酸序列，使用單個樣品標簽進行識別分類，容易造成樣品間數據量相差懸殊且引物合成成本較高；此外，引物處理繁瑣，易出錯，且對引物間的擴增不均衡不宜進行調整。

發明內容

為此，本發明提供一種檢測多個樣品時測序文庫的構建方法，用于解決現有技術中由于測序數據的歸類通過單個標簽進行識別容易導致的各樣品間數據量相差懸殊，引物合成成本較高且引物處理繁瑣，易出錯，對引物間的擴增不均衡不宜進行調整的問題。

為了實現上述目的，本發明的實施方式提供如下技術方案：

在本發明的實施方式的第一方面中，提供了一種檢測多個樣品時測序文庫的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：

步驟一、根據基因組DNA序列分別設計上游引物和下游引物；

步驟二、在每條上游引物上添加A接頭和第一標簽，得到上游融合引物，在每條下游引物上添加P接頭和第二標簽，得到下游融合引物，并將上游融合引物與下游融合引物混合得到混合融合引物；

步驟三、將混合融合引物、基因組DNA、含有Mg²⁺，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl緩沖液和無核酸酶水配制成多重PCR反應體系；

步驟四、將得到的多重PCR反應體系進行PCR反應、純化得到多樣品測序文庫。

本發明上述構建方法，在上游引物和下游引物的5’端分別依次增加標簽序列和接頭序列，并合成融合引物，其中上下游引物采用不同標簽序列，即能夠通過含不同序列的第一標簽與不同序列的第二標簽任意組合以識別樣品，進而能夠大大降低引物合成量；此外，采用雙樣品標簽融合引物法相較于連接法，減少了擴增次數，有效降低樣品間的數據不均衡。

進一步地，所述第一標簽和第二標簽的序列不同，且分別為1-20核苷酸或類核苷酸的隨機序列。

進一步地，所述步驟四中，純化采用的方法為：吸取20μL PCR產物到一個1.5mL EP管中，再加入30μL磁珠，吸打混勻，室溫下平衡5分鐘；將混合物放在磁力架上，移除上清液后，用70％乙醇清洗磁珠兩次，加入20μL水洗脫，洗脫液即為構建完成的文庫。

在本發明的一個實施例中，所述A接頭或P接頭選自Ion PGM、Ion Proton或IonS5/S5XL測序平臺的接頭。