[發明專利]一種人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法和培養方法

在審

• 申請號: 201910049865.X
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109628386A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 周樺
• 申請（專利權）人: 周樺;何志旭;趙淑云
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法和培養方法，包含以下操作步驟：血清制作：將血液放入至離心機內進行離心操作，并取出血清部分備用，抗生素液制作：分別將100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1：2：1：3的比例充分混合，以此制得抗生素液備用。該人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法和培養方法，使用多種鹽溶液和抗生素作為輔助生長劑，使用較為普遍的牛犢血清作為基礎，同時采用添加NaHCO3和HEPES溶液的方式調節培養液的PH值，給卵母細胞提供生存條件的同時抑制了雜菌的生長，避免了由于雜菌感染而導致的研究困難，同時提高了卵母細胞的體外成熟率，降低了制造成本，降低研究難度的同時方便了使用者的使用。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體為一種人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法和培養方法。

背景技術

卵母細胞在卵子發生過程中進行減數分裂的卵原細胞，分為初級卵母細胞、次級卵母細胞和成熟的卵母細胞，它們分別是卵原細胞分化和DNA復制分裂后產生、第一次減數分裂和第二次減數分裂的產物，在卵母細胞研究過程中，需要對卵母細胞進行體外培養操作。

在現有技術中，所使用的培養液適用于過多種類的雜菌生存，因此容易出現由于雜菌感染而導致的研究困難，同時降低了卵母細胞的體外成熟率，所使用的培養液的所需材料中多為現成的生物體液提取加工而成，因此制造成本較高，增加研究難度的同時給使用者的使用帶來不便。

發明內容

（一）解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法和培養方法，解決了在現有技術中，所使用的培養液適用于過多種類的雜菌生存，因此容易出現由于雜菌感染而導致的研究困難，同時降低了卵母細胞的體外成熟率，所使用的培養液的所需材料中多為現成的生物體液提取加工而成，因此制造成本較高的問題。

（二）技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：

一種人卵母細胞的體外成熟培養液制備方法，包含以下操作步驟：

S1、血清制作：將血液放入至離心機內進行離心操作，并取出血清部分備用；

S2、抗生素液制作：分別將100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1：2：1：3的比例充分混合，以此制得抗生素液備用；

S3、離子液制作：分別將75IU/L rFSH、150IU/L rHCG、20% SPS、2mg/L EGF和25mmol/L丙酮酸鈉以1：3：2：2的比例充分混合，以此制得離子液備用；

S4、溶液混合：將步驟S1得到的血清、步驟S2得到的抗生素液和步驟S3得到的離子液以5：1：2的比例混合，并充分攪拌，以此得到營養液；

S5、PH值調試：檢測步驟S4中得到的營養液的PH值，通過添加3.7%的NaHCO3和HEPES溶液進行PH值的調試，并使得混合液PH值在范圍7.2-7.4內（即若PH值小于7.2，則添加NaHCO3，若PH值大于7.4，則添加HEPES溶液，直至PH值在7.2-7.4時為止），以此完成培養液的制作。

優選的，所述步驟S1中的血液為牛犢動脈血液。

優選的，所述步驟S4中充分攪拌的用時為30-40分鐘。

優選的，所述步驟S5中添加的NaHCO3和HEPES溶液的總質量不得超過原營養液質量的3%。

一種人卵母細胞的培養方法，包含以下操作步驟：

S1、培養皿的準備：根據培養的規模選擇容量適合的培養皿，并對所選的培養皿進行清洗和消毒操作；