[發明專利]一種抑制害蟲免疫反應的苦瓜素類化合物及其高效制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910049648.0
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109833337B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 許小霞;張展滔;金豐良;林曉菊;葉凱翔;鄭錦龍;孔錦榮;張茂新;凌冰
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07J63/00
• 分類號: C07J63/00;A61K36/42;A61P37/06;A01N65/08;A01N37/42;A01P7/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
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本發明公開了一種抑制害蟲免疫反應的苦瓜素類化合物及其高效制備方法和應用。本制備方法利用甲醇浸提苦瓜，進行三級高效液相色譜分離得到三種化苦瓜素類化合物：苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。本發明利用柱過載臨界點的多級液相色譜分離化合物，采用三級高效液相色譜分離，大大縮短高效液相色譜分離所需的總時間，提純過程耗時短、效率高，能定向高效大量地提純制備高純度的苦瓜素類化合物。所得的苦瓜素類化合物能有效的抑制多種農業害蟲的免疫反應，從而控制農業害蟲的種群增長，可以用于綠色健康防控害蟲殺蟲劑的應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種抑制害蟲免疫反應的苦瓜素類化合物及其高效制備方法和應用。

背景技術

苦瓜(Momordicacharantia L.)葫蘆科苦瓜屬蔓性草本植物，苦瓜性苦味寒，具有清熱解毒，在醫學抗突變和抗腫瘤等作用；在食品加工業和生物防治中，有抗蟲，抗菌及抗病毒作用。苦瓜素類化合物對脊椎動物安全無害，原材料綠色環保，易獲取等特點，是一種非常具有發展潛力的植物次生代謝產物。近幾年來苦瓜已成為國內外眾多學者的研究熱點，并陸續從苦瓜果實和種子分離純化出蛋白類化合物包括植物蛋白、苦瓜凝集素、α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、苦瓜素L、苦瓜素I和苦瓜素II、抗病毒蛋白MAP30、苦瓜啶和苦瓜抑制劑等多種物質。

發明人科研團隊一直致力于苦瓜素類化合物的提純及化合物的分離鑒定。目前已經發現苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ對小菜蛾幼蟲有較強拒食作用并嚴重抑制其生長發育；苦瓜素類化合物可顯著抑制亞洲玉米螟的生長發育及生殖能力；苦瓜素Ⅰ、苦瓜素L可顯著抑制亞洲玉米螟幼蟲體內的磷脂酶、海藻糖酶等活性；苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ可顯著抑制亞洲玉米螟的離體酚氧化酶活性；苦瓜素類化合物可嚴重破壞斜紋夜蛾卵巢細胞的正常生理；苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B對亞洲玉米螟Ofh細胞均具有有效的增殖抑制和致壞死作用。由此可見，苦瓜素類化合物對農業害蟲的防治具有重要意義。

目前，從苦瓜莖葉提取物中獲得了8種苦瓜素類化合物，其中，苦瓜素Ⅰ，苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L在苦瓜素類化合物中占比可達36.38％。但是苦瓜素類化合物在純化中獲得率低，純化步驟繁瑣，耗時過長。目前，提取苦瓜素類化合物的一般方法包括梯度萃取、硅膠柱層析以及高效液相色譜分離等。以凌冰提取苦瓜素類化合物的方法為例(表1所示)，具體步驟為乙醇浸提苦瓜莖葉，梯度萃取，硅膠柱層析，然后將獲得的提取物進行單級高效液相色譜分離，最終得到純度為95％以上的苦瓜素類化合物，提取過程總耗時約為121h，總提取率約為100mg/kg，產率約為0.83mg/h。梯度萃取需要多種有機溶劑，在多個萃取步驟中，苦瓜素類化合物的回收率都受到較大的損失；硅膠柱層析步驟繁瑣，成本高，耗時長，且分辨率不高；傳統的高效液相色譜分離法雖然能可以獲得純度達95％以上苦瓜素類化合物，但總耗時長，總提取效率低，不適用于大量制備苦瓜素類化合物。由于目前缺乏一種簡單高效的苦瓜素化合物的分離純化方法，嚴重制約了利用苦瓜素類化合物開發食品級純度的藥物或一種高效的生物源性殺蟲劑。

表1：

多酚氧化酶(PPO)具有黑化抵御入侵病原微生物的作用，是昆蟲免疫反應的重要組成部分。酚氧化酶原級聯激活系統普遍存在于所有無脊椎動物中，它是昆蟲最重要的體液免疫系統之一。外界的免疫刺激能夠誘導級聯反應上游的蛋白對酚氧化酶原激活酶的前體進行剪切激活，而激活后的酚氧化酶原激活酶能夠將無活性的酚氧化酶原剪切激活為有活性的酚氧化酶并最終生成細胞毒素物質來氧化外源物。抑制過氧化物酶活性可以導致昆蟲防御機制的廢除或機體異常軟化，兩者都可能導致病蟲害的防治，所以將酚氧化酶(PO)作為新型殺蟲劑的靶點具有新的、合理的作用模式，通過抑制酚氧化酶(PO)活性而使害蟲失去正常的防御能力或軟化為異常而達到防控害蟲的目的。

發明人科研團隊發現苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ可顯著抑制亞洲玉米螟的離體酚氧化酶活性，但是尚不清楚苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ在轉錄和翻譯水平是如何抑制酚氧化酶(PO)活性的，因此制約了拓寬以害蟲酚氧化酶原級聯激活系統為靶標的苦瓜素類殺蟲劑的開發和應用。

發明內容