[發(fā)明專利]一種腫瘤多細(xì)胞球的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910045320.1
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109609464A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉陽;楊雯霏;尹玉利;王毅;王云娟;賀艷
• 申請（專利權(quán)）人: 南華大學(xué)
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤多細(xì)胞球的制備方法。將腫瘤細(xì)胞與含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏性聚合物溶液在常溫下均勻混合，升高溫度到37℃，形成溫敏水凝膠原位包埋細(xì)胞，細(xì)胞在水凝膠內(nèi)部生長、增殖，從而形成多細(xì)胞球。所述溫敏水凝膠生物相容性和可降解性良好。所述的腫瘤多細(xì)胞球的制備方法簡單易行，通用性和重復(fù)性良好，可大批量構(gòu)建各種尺寸的多細(xì)胞球，在藥物篩選和腫瘤研究中具有廣闊的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤多細(xì)胞球的制備方法。

背景技術(shù)

多細(xì)胞球是一種良好的三維細(xì)胞培養(yǎng)體系，更好地模擬了體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)行為，為研究者提供了一個更接近體內(nèi)真實(shí)狀況的研究模型。腫瘤多細(xì)胞球可以更好地模擬腫瘤細(xì)胞之間以及細(xì)胞外基質(zhì)間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的微環(huán)境，可廣泛用于腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究、腫瘤干細(xì)胞的富集、藥物滲透和滯留能力的評價等方面。其次，多細(xì)胞球非常適合應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選，其兼具傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞二維平面培養(yǎng)和裸鼠移植性腫瘤兩種模型的優(yōu)點(diǎn)，且簡單易行，結(jié)論可靠，成本低，周期短，是一種理想的抗癌藥物的前期高通量篩選模型。

在實(shí)際應(yīng)用中，發(fā)展一種簡單、大尺度和可重復(fù)的多細(xì)胞球的制備方法是非常必要的。常用的腫瘤多細(xì)胞球的制備方法有液體覆蓋法、懸滴法、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器法、引入外界作用力法、三維水凝膠支架法等。

液體覆蓋法通常較難控制多細(xì)胞球的生長，影響因素較多。懸滴法是一種常見的制備尺度均一的多細(xì)胞球的方法，但其操作比較繁瑣，目前大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)仍然存在困難。旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器法在一定的剪切力作用下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞可能會受到一定程度的損傷。通過引入外界作用力可以在短時間內(nèi)使細(xì)胞聚集成球狀或團(tuán)狀，但是操作比較繁瑣，試劑昂貴，成本較高，并且可能存在一定的毒害作用。而三維水凝膠支架法使用水凝膠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而水凝膠一般具有類似人體組織的彈性和很高的含水量，可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，因而經(jīng)常被用來大批量的制備多細(xì)胞球。

溫敏性水凝膠材料是一類能對溫度產(chǎn)生快速響應(yīng)并產(chǎn)生可逆轉(zhuǎn)化的功能性聚合物，是一種良好的支架材料。常溫下溫敏性聚合物一般是可流動的液體，可以和各種種子細(xì)胞均勻的混合，而在生理溫度環(huán)境（37℃）迅速發(fā)生凝膠化形成三維水凝膠，從而將細(xì)胞原位包埋，不需要其它任何化學(xué)反應(yīng)，因而更為簡單、安全，且具有可逆性，非常適合用于培養(yǎng)多細(xì)胞球（Biomacromolecules, 2011, 12(3): 578-584）。

目前研究較多的一種制備多細(xì)胞球的溫敏性水凝膠是聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）。但是其具有一定的毒性和難降解性，應(yīng)用受到限制。近年來，含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏聚合物由于具有良好的生物相容性和可降解性受到了越來越多的關(guān)注（Progress in Polymer Science, 2014, 39: 1074-1095; Progress in PolymerScience, 2017, 66: 54-79）。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種腫瘤多細(xì)胞球的制備方法，包括以下步驟：將一定濃度的腫瘤細(xì)胞懸浮液與一定濃度的含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏性聚合物溶液在常溫下均勻混合；升高溫度到37℃，形成溫敏水凝膠原位包埋細(xì)胞；細(xì)胞在水凝膠內(nèi)部生長、增殖，最終形成多細(xì)胞球。

在上述制備方法中，優(yōu)選的，所述的含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏性聚合物為聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和2-甲基-2-丙烯酸-2-（2-甲氧基乙氧基）乙酯的共聚物，兩個單體單元的摩爾比為0:100 ~ 30:70。

優(yōu)選的，所述的含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏性聚合物的形態(tài)為線性聚合物、支化聚合物、樹枝狀聚合物、星形聚合物或微凝膠中的一種。

優(yōu)選的，所述的含有聚乙二醇（PEG）鏈段的溫敏性聚合物具有良好的溫度敏感性，體積相轉(zhuǎn)變溫度為20~37℃。