[發明專利]一種基因工程菌株實現全細胞轉化合成L-苯乳酸的方法

有效

• 申請號: 201910044513.5
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109593702B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 夏雨;茅菁菁;王周平;劉祖河;劉琦
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基因工程菌株實現全細胞轉化合成L?苯乳酸的方法，具體涉及一種能實現輔因子NAD⁺和NADH自循環的共表達苯丙氨酸脫氫酶和L?羥基異己酸還原酶的基因工程菌株，通過全細胞轉化底物L?苯丙氨酸合成L?苯乳酸的方法，屬于生物工程技術領域。用重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a?pdh?ldh的全細胞轉化合成L?苯乳酸，并且在添加表面活性劑的作用下全細胞轉化率可達到88.9％～95.6％。該方法實現了輔因子NAD⁺和NADH的自循環，減少了輔因子的添加量，降低了生產成本，在工業化合成L?苯乳酸領域有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種基因工程菌株實現全細胞轉化合成L-苯乳酸的方法，具體涉及一種能實現輔因子NAD⁺和NADH自循環的共表達苯丙氨酸脫氫酶和L-羥基異己酸還原酶的基因工程菌株，通過全細胞轉化底物L-苯丙氨酸合成L-苯乳酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-苯乳酸(L-phenyllactic acid，L-PLA)，即L-2-羥基-3-苯基丙酸，是PLA兩種手性對映異構體中的一種，與手性對映異構體D-PLA天然共存于乳酸菌發酵產物和蜂蜜中，具有特殊的生物活性，可以作為手性中間體廣泛應用于化工、醫藥、農藥和生物合成等領域。

L-PLA不僅對多種食源性致病菌有抑制作用，也能抑制大部分的革蘭氏陽性菌和陰性菌的生長，延長食品的保質期。L-PLA是小分子有機酸，穩定性高，親水性強，在食品和飼料中容易擴散，是L-苯丙氨酸的代謝產物，對人和動物細胞均無毒性，在食品防腐方面有很大的發展潛力。

L-苯乳酸的合成主要通過化學法和生物法，化學法合成步驟復雜，需要使用有機化學試劑，對環境造成一定的污染。相比較而言，L-苯乳酸的生物法制備反應條件溫和，工藝簡單，無需手性拆分。生物法還分為微生物發酵法、酶催化法和全細胞轉化法。微生物發酵法發酵時間長，產物需要分離，操作復雜。酶催化法需要消耗輔酶I，成本高，酶純化操作復雜，不適合工業化生產。全細胞轉化法避免了酶的分離純化，為酶催化反應提供了穩定的細胞環境，與發酵法比轉化時間短，在工業化合成L-苯乳酸領域有很大的潛力。

目前，以苯丙氨酸為底物轉化合成苯乳酸，并實現輔因子NAD⁺和NADH的循環，至少需要三個酶的參與，比如用氨基酸脫氨酶和乳酸脫氫酶轉化苯丙氨酸合成苯乳酸，還需在體系中添加葡萄糖脫氫酶，再在乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的作用下實現輔因子NAD⁺和NADH的循環。因此，提供一種操作簡便、成本低、轉化率高、適合工業化生產的L-苯乳酸合成方法，對于工業上制備L-苯乳酸有重要的應用價值。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種基因工程菌，共表達了苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)和L-羥基異己酸還原酶(L-HicDH)，苯丙氨酸脫氫酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，L-羥基異己酸還原酶含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本發明的一種實施方式中，以E.coli BL21(DE3)為宿主。

在本發明的一種實施方式中，以pET系列載體為表達載體。

本發明的第二個目的是提供一種構建上述基因工程菌的方法，將編碼苯丙氨酸脫氫酶的基因、編碼L-羥基異己酸還原酶的基因和載體通過酶切連接，得到重組質粒，將重組質粒轉入宿主細胞中。