[發(fā)明專利]一種用于快速檢測農藥殘留的復配酶液的制備方法

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• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109781718A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設計）人: 李綺敏;林丹;許銀葉;鐘肖瓊;廖瑋;張家意;王瑩;林涵梅;龔曉瑩;莊俊鈺;馮志強
• 申請（專利權）人: 廣東省食品工業(yè)研究所有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/33;C12N9/18
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 李海波

本發(fā)明公開了一種用于快速檢測農藥殘留的復配酶液的制備方法，包含以下步驟：（1）將新鮮的蚯蚓清洗干凈后冷卻，然后與預冷后的磷酸鹽緩沖溶液進行勻漿，得到蚯蚓血清酶液；（2）將新鮮的黃鰭鯛去骨、去皮，得到其肌肉組織，然后與預冷后的磷酸鹽緩沖溶液進行勻漿，得到黃鰭鯛肌肉組織酶液；（3）取蚯蚓血清酶液和黃鰭鯛肌肉組織酶液，將兩種酶液混合，加入TritonX?114或TritonX?100，再添加穩(wěn)定劑和磷酸鹽緩沖溶液制得混合酶液；（4）將步驟（3）制得的混合酶液在35～37℃的條件下加熱，然后冷卻至室溫，并使用離心機離心，離心后取上清液，得到復配酶液。該復配酶液為乙酰膽堿酯酶復配酶液，酶源豐富，提取簡單，可有效縮短乙酰膽堿酯酶的制備時間和生產成本。

技術領域

本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及一種用于快速檢測農藥殘留的復配酶液的制備方法。

背景技術

隨著人們生活水平的不斷提高，果蔬中農藥殘留的問題越來越受到社會各界的關注。有機磷和氨基甲酸酯類農藥是我國目前使用量最大的農藥，人攝入高劑量的農藥會引起急性中毒，而長期攝入低劑量濃度的農藥會引起神經傳導阻礙等疾病。因此，果蔬農藥殘留的檢測對于食品安全至關重要。

傳統的農藥殘留分析方法需要昂貴的儀器設備和專業(yè)技術人才，并且受到場地的限制。隨著快速檢測農藥殘留技術的出現，上述技術限制被打破。一般快速檢測農藥殘留技術所應用原理是：在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿酯酶的活性具有抑制作用，其抑制率與農藥的濃度呈正相關。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是生物神經傳導中的一種關鍵酶，在神經傳導中起著至關重要的作用，能高效水解神經傳遞物質乙酰膽堿（ACh），從而使膽堿能神經信號的傳遞終止。同時，乙酰膽堿酯酶也是有機磷和氨基甲酸酯類農藥的靶向酶，有機磷和氨基甲酸酯類農藥能使乙酰膽堿酯酶的活性顯著降低。利用這一特性，在農藥檢測中，乙酰膽堿酯酶的活性變化可作為農藥毒理學的一個敏感指標。因此，可以用乙酰膽堿酯酶的活性受抑制程度來檢測果蔬中的農藥殘留量。

目前乙酰膽堿酯酶提取的提取方法眾多。中國專利文獻CN101709304A中公開了突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達載體，其包含乙酰膽堿酯酶的提取方法，具體為通過基因工程改造得到突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達載體，在酵母細胞中表達突變基因，以此來獲得有活性的乙酰膽堿酯酶；

中國專利文獻CN107513526A中公開了一種農殘速測用酶的快速制備方法，旨在簡化乙酰膽堿酯酶的制備工藝，其以家蠅為酶源，從家蠅中提取乙酰膽堿酯酶酶液，再經過分裝、冷凍、干燥工序后，得到用于快速檢測農殘的乙酰膽堿酯酶；

中國專利文獻CN1472316中公開了一種乙酰膽堿酯酶的制備方法，以動物血液為酶源，其工藝步驟包括從酶源中提取乙酰膽堿酯酶酶液，以及用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶和用透析法脫硫酸銨，再將酶液濃縮，干燥，得到純化的乙酰膽堿酯酶。

通過上述專利文獻的所述的方法均能得到經過純化的乙酰膽堿酯酶，然而它們都涉及復雜的提取工藝，制備成本較高，制作周期較長，減弱了酶的活力，且純化倍數低，無法滿足批乙酰膽堿酯酶批量化生產的需求。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速檢測農藥殘留的復配酶液的制備方法，該復配酶液為乙酰膽堿酯酶復配酶液，酶源豐富，提取簡單，可有效縮短乙酰膽堿酯酶的制備時間和生產成本。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現：

一種用于快速檢測農藥殘留的復配酶液的制備方法，包含以下步驟：

（1）將新鮮的蚯蚓清洗干凈后冷卻，然后與預冷后的磷酸鹽緩沖溶液進行勻漿，得到蚯蚓血清酶液；

（2）將新鮮的黃鰭鯛去骨、去皮，得到其肌肉組織，然后與預冷后的磷酸鹽緩沖溶液進行勻漿，得到黃鰭鯛肌肉組織酶液；