[發明專利]一種白羊草-內生真菌共生體的構建方法

有效

• 申請號: 201910042721.1
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109804913B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 賈彤;柴寶峰
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00;A01C1/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司 14101
• 代理人: 劉寶賢

本發明公開了一種白羊草?內生真菌共生體的構建方法，選擇飽滿的白羊草種子，剝去內稃，得到純種子，將內生真菌菌絲扎入到發芽種子的分生組織部位，將完成轉接的植株放回新PDA培養基，在黑暗和光照交替條件下培養一周，移栽到無菌蛭石，連續檢測6個月染菌率。該方法操作簡單，成功率高，可有效提高人工轉接效率。將成功染菌植株的種子播種于野外原生生境中，從而達到培育穩定傳代的白羊草內生真菌共生體，服務于脆弱生態系統植物?微生物聯合修復。

技術領域

本發明涉及受損生態系統植物-微生物聯合修復技術，特別涉及禾草-內生真菌共生體的構建方法，具體屬于一種白羊草-內生真菌共生體的構建方法。

背景技術

白羊草[Bohtriochloa ischaemum(L.)Keng]是禾本科孔穎草屬多年生牧草，屬于喜溫中旱生植物。白羊草是根莖疏叢型下繁禾草，根系發達，具有短根莖，分蘗能力強，能形成大量基生葉叢。白羊草群落是我國暖溫帶森林草原區有代表性的植被類型，也是落葉闊葉林區森林破壞后出現的次生植被類型，廣泛分布于黃土高原東南部和南部的低山丘陵、梁峁頂部的溫暖帶地段。此外，白羊草具有抗旱、抗病等特征，在礦區植被修復中具有較大的優勢，逐漸成為優勢種群。

內生真菌(Endophyte)為生活在活體植物地上部分的組織中，而不引起宿主植物明顯病害癥狀的真菌。內生真菌的宿主植物包括草本、灌木、針葉樹和藻類等多個類群，其中研究最為廣泛的是與冷季型禾草共生的屬內生真菌，全世界至少有30個屬的禾草感染該屬內生真菌。近年來研究發現，礦區生態修復中，白羊草感染多種內生真菌，其中，白羊草感染的sibiria內生真菌，及其共生體對生物與非生物脅迫具有優良的抗逆性，因此，成功構建白羊草-內生真菌共生體對提高生態修復效率具有重要意義。

傳統的人工轉接構建方法主要對人工栽培禾草進行幼苗轉接，愈傷組織以及成株分蘗轉接法為主。幼苗轉接和愈傷組織轉接不但容易損傷宿主植物，而且成活率較低，很難在野外成功感染宿主并穩定的傳代。成株轉接的成活率雖然有提高，但對天然禾草宿主的成功染菌率相對較低，不利于大面積的天然禾草生態修復。目前，還未找到一種較為可行的白羊草-內生真菌共生體構建方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種染菌率較高的白羊草-內生真菌共生體的構建方法，并將該方法應用到受損生態系統的生物修復中。

本發明提供的一種白羊草-內生真菌共生體的構建方法，包括如下步驟：

(1)選擇飽滿的白羊草種子，將種子在無菌水中浸泡5分鐘后，剝去內稃，得到純種子置于滅菌后的干燥培養皿中；

(2)在超凈臺上，將種子胚軸朝下，且胚根對準菌落45°斜插入已純化的內生真菌菌落中；

(3)在25℃黑暗條件下培養7-10天，觀察培養皿上種子發芽情況，若有雜菌污染應及時切除；

(4)顯微鏡確定發芽種子的分生組織部位，先用無菌注射器針頭扎一個小孔，不戳穿植株，然后挑取少量內生真菌新鮮菌絲，滾成球形，將球形菌絲扎入小孔內完成轉接；

(5)將完成轉接的植株放回新PDA培養基，在黑暗和光照交替條件下培養7天后，移栽到無菌蛭石，每1-2個月檢測一次染菌率，檢測6個月。

本發明方法還適用于感染同類內生真菌的天然禾草，如亞利桑那羊茅、羽茅、高羊茅等。

與現有技術相比，本發明有益效果：

本發明在共生體構建過程中采用種子剝去內稃、菌絲扎入植株分生組織部位等措施，顯著提高轉接植株成活率以及宿主的成功染菌率，實驗結果表明，采用本發明方法成活植株中內生真菌轉接的成功率白羊草達到97％，亞利桑那羊茅達到95％。將成功染菌植株的種子播種于野外原生生境中，可較好實現野外原生生境中種植禾草-內生真菌共生體的目的，利用其耐重金屬性及抗逆優勢，可提高脆弱生態系統植物-微生物聯合修復效率。

附圖說明