[發明專利]基于小鼠小腸類器官的食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價方法

在審

• 申請號: 201910042299.X
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109880878A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 秦玉梅;韓劍眾;談國鳳
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了一種基于小鼠小腸類器官的食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價方法。該方法包括：(1)食物功效成分暴露方法；(2)小腸類器官生長特征記錄；(3)用于食物成分功效評價的生長特征參數提取及統計分析。相比于現有技術，本發明以完全再現體內小腸結構及形成特征的類器官為基礎，利用普通倒置顯微鏡動態記錄腸道類器官生長過程，通過腸道類器官生長表型特征參數?類器官形成率、面積擴增率及單個類器官出芽率，實現食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價。

技術領域

本發明涉及一種基于小腸類器官的食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價方法。

背景技術

營養物質的功效是評價食品功效和食品營養的重要指標，腸道又是人體最大的營養物質消化和吸收器官，因此，在腸道層面上食物對腸道表型特征的影響能夠直觀快速的反應食物的功效。過去，食物對小腸生長特性的影響評價以實驗動物為主，存在操作步驟多，耗時長，成本高，動物使用量大，動物不同個體之間存在大的差異性等缺點。而近十年發展起來的，以腸道干細胞或以含干細胞的隱窩為基礎體外培養形成的腸道類器官，完全再現了體內腸道細胞組成及結構形成過程，除此之外，腸道類器官體外培養還具有培養周期短、可多次傳代、高通量、高內涵及易于體外基因操作等優點，被廣泛應用與醫藥及基礎科學研究領域。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于小腸類器官的食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價方法。該方法區別于現有技術，通過以完全再現體內小腸結構及形成特征的類器官為基礎，優化了食物暴露小腸類器官方法，普通倒置顯微鏡動態記錄腸道類器官生長過程，通過腸道類器官生長表型特征參數-類器官形成率、擴增率及單個類器官出芽率，實現食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

基于小腸類器官的食物功效成分對小腸生長特性影響的快速評價方法，包括以下幾個步驟：

步驟一、將培養3代以上凍存小腸類器官復蘇后，24孔培養板1中培養4-5天，去除完全培養基，24孔培養板1的每孔中加入500微升預冷的無鈣、鎂離子磷酸鹽緩沖溶液后置于冰上，用移液槍反復吹打每個孔的復合凝膠至破碎，得到復合凝膠懸液1；用注射器吸取全部復合凝膠懸液1后推出，重復一次，使隱窩類似結構從小腸類器官中釋放，得到解離小腸類器官懸液1；將解離小腸類器官懸液1轉移至15毫升離心管1中，以200g轉速和4℃溫度下離心10分鐘，去除離心管1中上清液；向含有解離小腸類器官懸液1的離心管1中加入150-200微升冰上預融化的復合凝膠液，用移液槍吹打3-4次制成冰上預融化的復合凝膠懸液2；將復合凝膠懸液2按照每孔5微升體積接種于37℃預熱96孔培養板1中，每孔小腸類器官密度為30-80個/孔；將96孔培養板1置于溫度為37℃的二氧化碳培養箱中30分鐘；待復合凝膠完全聚合后，再向96孔培養板1的孔中加入120微升含特定濃度食物成分的完全培養基，不含食物成分的完全培養基作為對照，隨后每2天更換一次相應培養基；

步驟二、步驟一中，類器官接種于96孔板1兩小時后，4倍顯微鏡全景記錄類器官狀態，培養24小時后4倍顯微鏡再次全景記錄類器官狀態，隨后培養5或6天后，再次4倍顯微鏡再次全景記錄類器官狀態；

步驟三、分析步驟二中的接種2小時、24小時和5-6天后小腸類器官特征參數，包括：記錄培養2小時96孔板1中每孔單個類隱窩或囊狀結構個數，記為參數a；記錄培養24小時96孔板1中囊形結構表面積，記為參數b；記錄培養5-6天與培養24小時記錄相對應小腸類器官表面積，記為參數c；記錄培養5-6天與培養2h相對應每個小腸類器官形成芽體個數，然后求和得參數d；記錄培養5-6天與培養2h相對應形成典型多芽體類器官個數，記為參數e；

步驟四、根據步驟三中獲得類器官生長特征參數a，b，c，d和e，獲得小腸類器官生長表型參數1：類器官形成率＝e/a，表征腸道類器官存活率；參數2：類器官擴增率＝c/b，表征腸道干細胞分化能力；參數3：單個類器官出芽率＝d/統計類器官個數，表征腸道類器官增殖及分化能力。