[發明專利]一種利用L-氨基酸連接酶一步法合成L-肌肽的方法

有效

• 申請號: 201910040733.0
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109593805B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 朱益波;張璐;孫安迪;包承潤;鄒錦濤;于志勇
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12P17/10
• 分類號: C12P17/10;C12N15/70;C12N9/12;C12N9/00
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 滕詣迪

本發明公開了一種利用L?氨基酸連接酶一步法合成L?肌肽的方法，該方法以β?丙氨酸、L?組氨酸、ATP和聚磷酸鹽為原料，MgCl₂為激活劑，加入L?氨基酸連接酶和聚磷酸鹽激酶，在pH值為6.5?8.5,30?45℃溫度條件下通過酶促反應偶聯催化合成L?肌肽；本發明的方法，由序列優化過后的L?氨基酸連接酶基因在大腸桿菌中成功獲得表達，并能一步催化β丙氨酸和L?組氨酸合成L?肌肽。底物無需經過甲酯化或者基團保護；催化反應中所需要的ATP由聚磷酸激酶催化ADP磷酸化不斷再生，只需消耗少量的ADP即可實現ATP的循環再生；且再生原料六偏磷酸鈉來源廣泛，成本低廉，操作簡單，易于規模化生產。

技術領域

本發明涉及一種合成肌肽的方法，具體是一種利用L-氨基酸連接酶一步法合成L-肌肽的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

L-肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸)及其類似物(如高肌肽和鵝肌肽)，是廣泛存在于哺乳動物的大腦、肌肉和其他重要組織中的天然活性二肽。自該活性肽發現的一百多年來，已有大量的研究發現或者證明L-肌肽具有顯著的抗氧化、消除胞內自由基、抗衰老等活性，并且在臨床上用于高血壓、心臟病、老年性白內障、潰瘍、抗腫瘤、促進傷口愈合等方面的輔助治療。由于其抗氧化的活性強，毒副作用低并具有多種生理活性，該活性肽及其衍生物在醫藥、保健、衛生、化妝品等領域已有廣泛的應用，市場空間廣闊。

目前L-肌肽的生產主要采用化學合成法。已有的化學合成方法比較多，主要可以分為兩大類：(1)利用β-丙氨酸參與合成。其主要路線是β-丙氨酸經氨基保護、羧基活化后與保護的L-組氨酸縮合，然后脫掉保護基團得到L-肌肽。該路線由于各個保護基團的差異導致合成路線較多。其中常用的方法是利用鄰苯二甲酸酐與β-丙氨酸生成鄰苯二甲酰-β-丙氨酸保護氨基，羧基與氯化亞砜反應生成鄰苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再與保護的L-組氨酸形成肽鍵后脫保護基團得到產品。該路線比較復雜，收率低，肽鍵形成過程中易消旋，影響產品純度，并且溶劑消耗大，易造成環境污染；(2)無β-丙氨酸參與的反應：主要原理為L-組氨酸先與不同的β-丙氨酸前體生成肽鍵，再進一步轉換為肌肽。常用的路線是在醇鈉作用下，L-組氨酸和氰乙酸乙酯發生酰化反應，得到氰基乙酰-L-組氨酸，經催化氫化還原得L-肌肽。該路線相對簡單，省去對不同基團的保護和脫保護的過程，避免消旋反應的發生，但是需要無水操作，要求嚴格。同時，氰乙酸乙酯為環境毒害物質，易引起水體污染和毒性反應。

目前，已有采用溫和環保的酶催化合成取代傳統化學合成工藝的報道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯與L-組氨酸一步合成L-肌肽(申請公布號為CN107217048A的專利文獻)。該方法依然需要將β丙氨酸甲酯化，并且反應液中合成的L-肌肽會被氨肽酶降解為β-丙氨酸和L-組氨酸，同時，氨肽酶會形成三肽，導致反應產物復雜、提取純化困難。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用L-氨基酸連接酶一步法合成L-肌肽的方法，該方法具有原料價格低廉、酶轉化時間短、操作簡便以及生產成本低等優點，具有較好的應用潛力。

為了達到上述技術目的，本發明的技術方案是：

一種利用L-氨基酸連接酶一步法合成L-肌肽的方法，該以β-丙氨酸、L-組氨酸、ATP和聚磷酸鹽為原料，MgCl2為激活劑，加入L-氨基酸連接酶和聚磷酸鹽激酶，在pH值為6.5-8.5,30-45℃溫度條件下通過酶促反應偶聯催化合成L-肌肽。

具體地，包括以下步驟：

(1)分別構建L-氨基酸連接酶的基因重組表達載體pET-ywfE和聚磷酸鹽激酶的基因重組表達載體pET-PPK，其中，L-氨基酸連接酶基因來源于Bacillus subtilis BGSC3A2，GI：1094636766，該序列經密碼子優化后如SEQ ID NO.1所示；聚磷酸鹽激酶基因來源于E.coli K-12(MG1655)，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。