[發明專利]一種全細胞一步合成L-肌肽的方法

有效

• 申請號: 201910040717.1
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109609536B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 朱益波;王志杰;孫啟武;賴淑涵;彭鑫成;楚銀鳳
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12P17/10
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 滕詣迪

本發明公開了一種全細胞一步合成L?肌肽的方法，包括以下步驟：1)構建重組載體，所述重組載體含有核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的氨基酸脂酰基轉移酶基因，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；2)將核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的基因轉入大腸桿菌獲得重組大腸桿菌；3)將底物β?丙氨酸甲酯以及L?組氨酸溶于緩沖溶液，pH值為7.5?9.5；4)將重組大腸桿菌加入緩沖溶液中進行反應，反應溫度25?42℃；本發明利用該基因的重組質粒和重組工程菌在催化體系中直接催化合成L?肌肽，提高了L?肌肽的轉化率，同時解決了氨肽酶法催化過程繁復的酶分離純化和高成本的難題。

技術領域

本發明涉及一種肌肽的合成方法，具體是一種直接采用重組大腸桿菌作為全細胞催化劑高效率合成L-肌肽的方法，屬于生物生產技術領域。

背景技術

L-肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸)及其類似物(如高肌肽和鵝肌肽)，是廣泛存在于哺乳動物的大腦、肌肉和其他重要組織中的天然活性二肽。自該活性肽發現的一百多年來，已有大量的研究發現或者證明L-肌肽具有顯著的抗氧化、消除胞內自由基、抗衰老等活性，并且在臨床上用于高血壓、心臟病、老年性白內障、潰瘍、抗腫瘤、促進傷口愈合等方面的輔助治療。由于其抗氧化的活性強，毒副作用低并具有多種生理活性，該活性肽及其衍生物在醫藥、保健、衛生、化妝品等領域已有廣泛的應用，市場空間廣闊。

目前L-肌肽的生產主要采用化學合成法。已有的化學合成方法比較多，主要可以分為兩大類：(1)利用β-丙氨酸參與合成。其主要路線是β-丙氨酸經氨基保護、羧基活化后與保護的L-組氨酸縮合，然后脫掉保護基團得到L-肌肽。該路線由于各個保護基團的差異導致合成路線較多。其中常用的方法是利用鄰苯二甲酸酐與β-丙氨酸生成鄰苯二甲酰-β-丙氨酸保護氨基，羧基與氯化亞砜反應生成鄰苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再與保護的L-組氨酸形成肽鍵后脫保護基團得到產品。該路線比較復雜，收率低，肽鍵形成過程中易消旋，影響產品純度，并且溶劑消耗大，易造成環境污染；(2)無β-丙氨酸參與的反應：主要原理為L-組氨酸先與不同的β-丙氨酸前體生成肽鍵，再進一步轉換為肌肽。常用的路線是在醇鈉作用下，L-組氨酸和氰乙酸乙酯發生酰化反應，得到氰基乙酰-L-組氨酸，經催化氫化還原得L-肌肽。該路線相對簡單，省去對不同基團的保護和脫保護的過程，避免消旋反應的發生，但是采用了易水解的醇納，需要無水操作，要求嚴格，并未工業化應用。同時，氰乙酸乙酯為環境毒害物質，易引起水體污染和毒性反應。

目前，已有采用溫和環保的酶催化合成方法，以取代傳統化學合成工藝的報道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯與L-組氨酸一步合成L-肌肽(申請公布號為CN107217048A的專利文獻)。采用重組氨肽酶全細胞合成L-肌肽等方法的報道(Heyland J,N Antweiler,JLutz,et al.Simple enzymatic procedure for L-carnosine synthesis:whole-cellbiocatalysis and efficient biocatalyst recycling[J].Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。然而，由于氨肽酶具有很高的外切酶活力，導致在反應體系中無法積累高濃度的L-肌肽。并且，利用氨肽酶合成L-肌肽對反應體系要求較高，往往需要水相和有機相體系，以減少產物的水解作用。但是有機相對酶的活力存在一定程度抑制，氨基酸底物在有機相中溶解度也較低，種種原因都導致基于氨肽酶合成L-肌肽的產量很低(最優結果是3.7g/L，Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。除此之外，氨肽酶會形成三肽，導致反應產物復雜、提取純化困難、L-肌肽得率較低(Heck T,V S Makam,J Lutz,etal.Kinetic Analysis of L-Carnosine Formation byβ-Aminopeptidases.AdvancedSynthesisCatalysis,2010,352(2-3):407-415.)。并且，采用生物酶法制備、分離成本高昂，難以回收再利用，不利于大規模運用。

發明內容