[發明專利]一種非變性膠原蛋白提取方法和膠原蛋白的鑒定方法

有效

• 申請號: 201910040679.X
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109627326B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 孫圣偉;何健;劉美娟;楊曉惠;殷光玲;張旭光
• 申請（專利權）人: 湯臣倍健股份有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12P21/06;C07K1/30;C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

本發明屬于膠原蛋白技術領域，尤其涉及一種非變性膠原蛋白提取方法和膠原蛋白的鑒定方法。本發明提供了一種非變性膠原蛋白提取方法，包括以下步驟：a)將膠原蛋白加入孵育液進行孵育，離心，得到不溶物；b)將所述不溶物依次進行酶解、中和、鹽析，得到非變性膠原蛋白；其中，所述孵育液選自Tris?HCl溶液、Bis?Tris溶液、咪唑緩沖液或胰蛋白酶培養液。實驗結果表明，本發明采用孵育液對膠原蛋白進行孵育，可除去變性膠原蛋白，對非變性膠原蛋白進行提取，可提高膠原蛋白產品的活性。

技術領域

本發明屬于膠原蛋白技術領域，尤其涉及一種非變性膠原蛋白提取方法和膠原蛋白的鑒定方法。

背景技術

蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命，蛋白質是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與，人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內不斷進行代謝與更新。如載體蛋白對維持人體的正常生命活動至關重要，可以在體內運載各種物質；人體細胞里每分鐘要進行一百多次生化反應，酶對生化反應具有催化和調節功能，并且酶有促進食物的消化、吸收、利用的作用；球蛋白是一種存在于人體中的血清蛋白，被稱為免疫球蛋白，具有免疫作用。

膠原蛋白是一種生物高分子纖維蛋白，是動物結締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質總量的25％～30％。膠原蛋白主要從動物皮膚或骨骼(如魚皮/鱗、豬皮/骨、牛皮/骨等)中進行提取得到，再進行水解得到膠原蛋白肽，膠原蛋白肽可溶于冷水，且易被人體吸收利用，具有傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等功效。膠原蛋白有不同的類型，目前為止已經發現了幾十種。其中Ⅰ型膠原蛋白主要存在于皮膚血管等結締組織中；Ⅱ型膠原蛋白主要由軟骨細胞產生，多存在于骨骼、關節、肌腱等組織，對消化酶有一定抵抗作用，口服后有可能在小腸經胰蛋白酶作用產生活性片段，刺激胃腸道黏膜免疫系統，從而起到口服誘導免疫耐受的作用，可預防或緩解類風濕性關節炎病癥；Ⅲ膠原蛋白型在皮膚、血管壁、子宮壁中含量豐富；Ⅳ型主要在晶狀體中含量豐富；Ⅴ型主要在皮膚和血管壁中含量豐富。

膠原蛋白會在高溫和酸水解中變性，形成變性膠原蛋白，變性膠原蛋白的三、四級結構會遭到破壞，使得膠原蛋白的活性降低。但是，現有技術還不能對膠原蛋白進行純化，進行非變性膠原蛋白的提取。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種非變性膠原蛋白提取方法和膠原蛋白的鑒定方法，用于解決現有技術不能對膠原蛋白進行純化，進行非變性膠原蛋白的提取的問題。

本發明的具體技術方案如下：

一種非變性膠原蛋白提取方法，包括以下步驟：

a)將膠原蛋白加入孵育液進行孵育，離心，得到不溶物；

b)將所述不溶物依次進行酶解、中和、鹽析，得到非變性膠原蛋白；

其中，所述孵育液選自Tris-HCl溶液、Bis-Tris溶液、咪唑緩沖液或胰蛋白酶培養液。

實驗結果表明，本發明采用孵育液對膠原蛋白進行孵育，可除去變性膠原蛋白，對非變性膠原蛋白進行提取，可提高膠原蛋白產品的活性。

本發明中，孵育液優選為胰蛋白酶培養液，胰蛋白酶培養液的制備方法包括：將胰蛋白酶溶于提取緩沖液中，攪拌均勻，并用水稀釋得到。

提取緩沖液通過將10～50mg蛋白酶抑制劑、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA和Tris混合，加入10～20mL 0.5M HCl，用水稀釋得到。

胰蛋白酶在胰蛋白酶培養液中的質量濃度為0.5～3.0mg/mL，優選為2.0mg/mL。