[發明專利]耐熱性提高的羰基還原酶突變體

有效

• 申請號: 201910033683.3
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109852592B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 吳中柳;李同彪;李孜一;劉艷;裴小瓊
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體是以理性設計的方案，利用consensus方法以及FirePort在線網站識別了4個與羰基還原酶ChKRED03熱穩定性相關的位點，并將有益突變位點進行整合，獲得熱穩定性大幅度提高的組合突變體。這些耐熱性提高的突變體更利于工業應用。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體內容涉及耐熱性提高的羰基還原酶突變體。

背景技術

作為氧化還原酶家族的一員，羰基還原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.184)能夠催化羰基的不對稱還原生成相應的手性醇。手性醇是一類重要的有機合成砌塊，在醫藥、農業、食品和化工等行業都有很高的應用價值。利用羰基還原酶生物催化生產手性醇越來越廣泛地應用于工業生產中。

為了適應極端工業環境下的應用，如極端溫度、強酸堿環境等，對羰基還原酶的酶學性能提出了更高的要求，理想條件是酶能夠在這些環境下保持良好的活力和穩定性。其中酶的熱穩定性是工業應用的重要指標。高溫條件下，酶的催化效率高，反應周期短，可以有效地提高時空產率，節約成本，且便于操作，也有利于避免反應過程中被其他微生物污染。

分子改造技術為研究酶的底物特異性和催化活性位點、改善酶的熱穩定性以及提高酶作用溫度等提供了有效手段。通過分子改造，可以快速定向地獲得符合工業需求的酶。定向進化和理性/半理性設計是酶分子改造的主要技術手段，也是當前酶工程領域研究的熱點。目前，已有許多學者運用這項技術成功的改造了各種各樣的酶，取得了令人矚目的進展(C.A.Denard,H.Ren and H.Zhao,Curr Opin Chem Biol,2015,25,55-64.)。其中，定點突變技術已成為酶分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白質的進化過程(H.Yang,J.Li,H.D.Shin,G.Du,L.Liu and J.Chen,Appl Microbiol Biotechnol,2014,98,23-29.)。

發明內容

本發明以理性設計的方案，利用consensus方法以及FirePort在線網站預測來源于金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)的羰基還原酶ChKRED03(氨基酸序列為SEQID NO.2)熱穩定性相關的氨基酸位點，并進行分子改造，利用定點突變技術進行單點突變和組合突變，從而獲得熱穩定性提高的突變體。

所述羰基還原酶突變體是以SEQ ID NO.2為出發序列，將第183位的蘇氨酸突變為纈氨酸，或者將第183位的蘇氨酸突變為異亮氨酸，或者將第188位的天冬酰胺突變為亮氨酸，或者將第211位的丙氨酸突變為脯氨酸，或者將第224位的絲氨酸突變為輔氨酸，或者以上四個位點的任意組合得到的突變體。

根據本領域公共知識，構建的能表達上述突變體的載體、基因工程菌等也屬于本發明的保護范圍。

為了達到以上目的，本發明根據理性設計預測得到的氨基酸位點，以定點突變技術對母本羰基還原酶ChKRED03基因進行突變，獲得5個熱穩定性提高的單點突變體。以定點突變技術將單點突變體進行多位點整合，獲得3個耐熱性進一步提高的組合突變體。

本發明的具體技術方案為：