[發(fā)明專利]一種犬瘟熱病毒復(fù)制缺陷毒株及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910033605.3
• 申請(qǐng)日: 2019-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN109750006A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃娟;單虎;林佳旭;秦志華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N5/10;A61K39/175;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明涉及一種犬瘟熱病毒的犬瘟熱病毒復(fù)制缺陷株的拯救及驗(yàn)證，該系統(tǒng)包含：轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI?CDV?SD16F能夠表達(dá)所述犬瘟熱病毒流行毒株SD16F的基因組全長cDNA序列，經(jīng)定點(diǎn)突變后的pCI?CDV?SD16F?M質(zhì)粒為不表達(dá)M蛋白的重組質(zhì)粒；和一個(gè)或多個(gè)輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒能夠表達(dá)所述犬瘟熱病毒SD16F流行毒株的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)；可穩(wěn)定表達(dá)SD16F M蛋白的Vero?SLAM?M細(xì)胞系。通過上述反向遺傳操作系統(tǒng)，成功的拯救出重組復(fù)制缺陷犬瘟熱病毒。本研究所述的犬瘟熱病毒流行毒株復(fù)制缺陷毒株為新型犬瘟熱基因工程生物防治制劑的研制創(chuàng)造了便利條件及犬瘟熱病毒相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了極佳的技術(shù)平臺(tái)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒反向遺傳操作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬瘟熱病毒復(fù)制缺陷毒株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

犬瘟熱(Canine distemper,CD)是一種可導(dǎo)致多種動(dòng)物共患的高度接觸性傳染病，由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)中的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染所引起的。在自然條件下，最為易感的動(dòng)物以犬科、鼬科、貓科等肉食獸為主，感染后的死亡率極高。

CDV為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，主要編碼有6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)。免疫接種是目前防制犬瘟熱的主要手段，滅活苗對(duì)CDV強(qiáng)毒攻擊不能提供完全的保護(hù)，因此，弱毒活疫苗被廣泛應(yīng)用于犬和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物犬瘟熱的防制。商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株多是通過將分離的強(qiáng)毒株經(jīng)異種動(dòng)物(雪貂等)、雞胚或細(xì)胞連續(xù)傳代以致弱，如CDV/R-20/8株、 Onderstepoort株等，但是這種致弱方法獲得的弱毒株存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，而且疫苗株對(duì)野生動(dòng)物有不同程度的致病性；少數(shù)商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株是從自然界分離篩選獲得的自然弱毒株，如用于狐貍的CDV-11株，是從體溫一過性升高的犬分離獲得，對(duì)犬、貉、水貂、狐貍均安全，但該疫苗株在動(dòng)物體內(nèi)可自主復(fù)制，在免疫接種時(shí)存在散毒風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)野生動(dòng)物的安全性也未知。

與傳統(tǒng)致弱方式相比，以反向遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，利用點(diǎn)突變毒力基因相關(guān)位點(diǎn)及病毒拯救的方法獲得減毒株，具有病毒致弱機(jī)制更明確的優(yōu)點(diǎn)；將病毒基因組某個(gè)復(fù)制必須蛋白基因缺失，獲得病毒復(fù)制缺陷毒株，該毒株只能在提供該蛋白的復(fù)制許可細(xì)胞上復(fù)制，在其他細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)均無復(fù)制性，接種動(dòng)物后通過一次性感染使其獲得免疫力，而不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，更不會(huì)排毒，因此更加安全。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種犬瘟熱病毒流行毒株復(fù)制缺陷毒株及其構(gòu)建方法，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。

本發(fā)明首先提供一種構(gòu)建犬瘟熱病毒流行毒株復(fù)制缺陷毒株的方法，包括如下的步驟：

1)在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中插入不表達(dá)M蛋白的犬瘟熱病毒基因組全長cDNA序列，獲得重組質(zhì)粒；

所述的不表達(dá)M蛋白，是經(jīng)過定點(diǎn)突變獲得的；

其一種具體的定點(diǎn)突變，是在M基因起始密碼子處進(jìn)行堿基定點(diǎn)突變，將A 堿基突變?yōu)镃。

2)構(gòu)建輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒能夠表達(dá)犬瘟熱病毒的核蛋白NP、磷蛋白P及大聚合酶蛋白L；

3)構(gòu)建表達(dá)犬瘟熱病毒M蛋白的細(xì)胞系，所述的細(xì)胞系為Vero-SLAM-M 細(xì)胞系；

4)使用重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)犬瘟熱病毒M蛋白的細(xì)胞，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞懸液中拯救出重組犬瘟熱病毒流行毒株復(fù)制缺陷株。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種用于制備犬瘟熱病毒復(fù)制缺陷株的制品：所述的制品包含有：

1)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為插入不表達(dá)M蛋白的犬瘟熱病毒基因組全長cDNA序列的重組質(zhì)粒；