[發明專利]一種基于RAA熒光法快速檢測呼吸道腺病毒的引物、探針及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910029711.4
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109652595A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 鄭偉;王剛;呂沁風;楊天賜;王玲;吳忠華;郭利川;湯賽君;王智宏;應清界
• 申請（專利權）人: 浙江國際旅行衛生保健中心(浙江出入境檢驗檢疫局口岸門診部);江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發明提供一種基于RAA熒光法檢測呼吸道腺病毒的引物、探針及檢測試劑盒，所述引物和探針適用于RAA熒光法檢測，并且能夠準確地檢測出呼吸道腺病毒，特異性能夠達到100%，所述檢測試劑盒能夠方便快速且準確地鑒定呼吸道腺病毒，操作方便，檢測時間短，15 min內可以完成檢測，無需像PCR一樣通過高溫95℃變性使DNA解旋，再在50~60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30~42℃下進行等溫擴增即可完成檢測。也無需像LAMP技術一樣使用4?6條引物在65℃情況下進行擴增且容易產生假陽性。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其是涉及一種基于RAA熒光法快速檢測呼吸道腺病毒的引物、探針及檢測試劑盒。

背景技術

腺病毒是兒童急性呼吸道感染中最常見的病毒病原之一。該病毒可通過人、水、媒介物和器械傳播，室溫條件下，在污物中存在周期可延長至3周。腺病毒在兒童和軍營人員中更易發生感染和大規模流行，大多數嬰幼兒在出生后的5年內至少感染過1種腺病毒株。脂類消毒劑無效，對熱、甲醛、氯敏感。腺病毒感染分布全球，全年均可發生。腺病毒可以感染呼吸道、腸道、眼睛、膀胱以及肝臟等，并在人群中造成流行疾病的傳播。腺病毒侵入宿主細胞后至少能引起3種感染：慢性、潛伏性感染：常在淋巴細胞內發生，潛伏感染時外放的病毒量極少,細胞壞死也不明顯，故臨床上感染不明顯，潛伏感染的機制尚不清楚。溶解性感染：病毒在細胞內如人類上皮細胞中經歷復制過程，通過溶解細胞作用使細胞死亡。腫瘤樣變異：此時病毒繁殖只進行最初幾步，然后腺病毒DNA與細胞DNA整合并復制，但不產生感染性病毒，腺病毒抗原性較穩定。

腺病毒(Adenovirus，ADV)是無囊膜的線性雙股DNA病毒，根據宿主范圍不同，分為哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬。人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)，根據免疫學、生物學、生物化學特性不同，將其分為A-G7個亞種，共有52個血清型，不同的血清型有不同的器官親和性并引起相應的臨床表現，與呼吸道有關的是B、C和E組。其中3型和7型是引起兒童呼吸道腺病毒感染最常見的型別。人類腺病毒是一種沒有包膜的直徑為70-100nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構成。每個殼粒的直徑為7～9nm，其中六鄰體240個，五鄰體12個。六鄰體帶有主要的屬和亞屬抗原決定簇和次要的種抗原決定簇，而五鄰體帶有主要的種抗原決定簇和次要的亞屬抗原決定簇。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35000bp，兩端各有長約100bp的反向重復序列。依據DNA同源性的不同人類腺病毒的49個型分為7個亞屬A-G(其中G尚有不同看法)。

目前診斷呼吸道腺病毒的實驗室檢測方法主要包括病毒分離培養法檢測、血清學診斷、血清抗體檢測及分子生物學方法檢測。

病毒分離通常是腺病毒感染檢測的金標準，方法是將臨床標本接種于敏感細胞，如肺癌A549、Hela、Hep-2等細胞，通過觀察細胞病變，可以觀察期致病性，同時還可以使病毒增值。由于細胞培養所檢測出的病毒是具有感染性的病毒，所以可在一定程度上確定為引起呼吸道感染的病原體。但是由于細胞病變一般2-7天出現，因此該方法周期較長，且比較繁瑣。

免疫熒光技術不僅可用于細胞培養中病毒的鑒定，也可用于臨床標本中病毒抗原的檢測，具有快速簡便、特異性高的特點，但是其敏感性較低。

分子生物學方法如實時熒光PCR具有靈敏度，特性好，但需要專業技術人員和復雜的儀器和完備的實驗室，時間周期也需要1.5-2小時；逆轉錄環介導等溫擴增法(LAMP)具有等溫60-65℃，具有很好的特異性，但假陽性率較高，引物設計復雜。

重組酶介導的等溫核酸擴增技術(簡稱為RAA技術)是一種利用重組酶代替PCR高溫變性，完成對雙鏈的解鏈，解開的雙鏈被單鏈結合蛋白結合，防止DNA鏈復性。再由聚合酶完成鏈的延伸，以DNA為模板合成目的產物，反應在30-42℃條件下進行5-20分鐘完成擴增。

發明內容

本發明的第一個目的在于，針對現有技術中存在的不足，提供一種基于RAA熒光法檢測呼吸道腺病毒的引物。