[發明專利]一種基于通用探針檢測胎兒染色體變異的方法

在審

• 申請號: 201910029334.4
• 申請日: 2019-01-13
• 公開（公告）號: CN109628578A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 陳芊如;祝令香;郭永;王芳;王棟;劉燁;朱宏艷;楊文軍;高娜
• 申請（專利權）人: 清華大學;北京新羿生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種基于通用探針檢測胎兒染色體變異的方法，所述方法包括以下步驟：提取胎兒染色體變異的待測樣本中的游離DNA和/或細胞DNA；篩選至少一種待測染色體和至少一種參考染色體的待測靶標區域；設計擴增引物對與通用探針；擴增和檢測，和通過待測染色體和參考染色體的待測靶標區域檢測到熒光信號的相對比例，確定待測染色體的變異情況。本發明方法具有更簡單的操作流程，利于臨床應用，將是產前檢測領域的新方向。

技術領域

本發明涉及明涉及體外診斷檢測領域，具體涉及一種基于通用探針檢測胎兒染色體變異的方法。

背景技術

數字PCR作為一種能夠對核酸進行絕對定量分析的方法，被提出用于檢測胎兒染色體變異，如非整倍體變異。基于數字PCR的檢測方法具有簡單、快速和低成本的潛力，但是其臨床應用受到限制：需要大量的PCR陽性反應單元以達到準確可靠的檢測結果。使用多重數字PCR可以提供足夠多的PCR陽性反應單元，且而無需添加額外的操作流程或增加DNA投入量。然而，當數字PCR的重數逐漸增加時，需要相應大量的探針來實現多重的數字PCR，這將導致背景熒光升高而影響陽性信號的檢測，因而無法實現足夠重數的數字PCR檢測。因此，需要一種低背景熒光信號的多重數字PCR檢測方法用于產前檢測領域。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種基于通用探針檢測胎兒染色體變異的方法，所述方法包括以下步驟：步驟1，提取胎兒染色體變異的待測樣本中的游離DNA和/或細胞DNA；步驟2，篩選至少一種待測染色體和至少一種參考染色體的待測靶標區域，待測染色體和參考染色體的待測靶標區域數量相同且至少各為二個；步驟3，根據步驟2篩選的待測染色體和參考染色體的待測靶標區域分別設計相應擴增引物對與通用探針；對于每個待測染色體和每個參考染色體各自的待測靶標區域分別設置一條通用探針，待測染色體的通用探針靶向待測染色體的所有待測靶標區域，參考染色體的通用探針靶向參考染色體的所有待測靶標區域；兩條通用探針的核酸序列不相同，并使用不同的熒光基團進行標記；步驟4，對步驟2中挑選的靶標區域利用步驟3的引物和探針進行擴增和檢測，每種待測染色體和每種參考染色體的待測靶標區域進行檢測時分別產生一種不同的熒光信號；和步驟5，通過待測染色體和參考染色體的待測靶標區域檢測到熒光信號的相對比例，確定待測染色體的變異情況。

在一種實施方式中，所述染色體變異包括染色體非整倍變異、染色體缺失變異、染色體重復變異。

在一種實施方式中，所述待測樣本包括母體外周血、羊水、絨毛膜組織、臍靜脈血、宮頸內胎兒細胞。

在一種實施方式中，步驟2所述的每條染色體的待測靶標區域數量5-500個，優選為10-200個，更優選為20-100個；待測靶標區域之間的間隔大于200bp，待測靶標區域中不含有SNP位點、GC含量為40-60％和無重復序列。

在一種實施方式中，步驟2的所述通用探針為一段與待測靶標區域互補的長度為8-25nt的寡核苷酸，通用探針至少一個堿基具有LNA或MGB或PNA標記。

在一種實施方式中，所述待測染色體是人的13號染色體、18號染色體、21號染色體、X染色體或Y染色體；和所述參照染色體是人的1-12號染色體中任一個。

在一種實施方式中，步驟2所述的通用探針5′端標記熒光基團，3′端標記淬滅基團；所述熒光基團包括FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TED、NED、Cy5、Cy5.5；所述淬滅基團包括BHQ1、BHQ2、BHQ3。

在一種實施方式中，所述方法基于多重數字PCR的方法。

在一種實施方式中，所述待測染色體是人的21號染色體，所述參考染色體是人的5號染色體；21號和5號染色體靶標區域數量分別為5個；21號染色體的通用探針序列為C+C+CT+G+CCT+CT，5號染色體的通用探針序列為C+C+CA+C+CTC+CA，其中+表示鎖核酸標記。