[發明專利]猴馬爾堡病毒實時熒光RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201910028294.1
• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN109504808A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 張體銀;李丹丹;邱香果;鄭騰;王武軍;張志燈;林素潔
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.猴馬爾堡病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物及探針，其特征在于：包括上游引物MbV-F、下游引物MbV-R及TaqMan探針MbV-P，各引物核苷酸序列如下：

上游引物MbV-F：5’- TTG GTG CGG ACC TCC AAA GT -3’；

下游引物MbV-R：5’- GCG CAA TTG CTG AGA GCT GA -3’；

TaqMan探針MbV-P：5’- FAM-AGC AGG CGT TGA GCA ACC TAG CCC GA- 3’；

探針的 5’端和3’端分別采用熒光基團FAM和BHQ1進行修飾。

2.一種如權利要求1所述實時熒光RT-PCR檢測的引物及探針在檢測猴馬爾堡病毒中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于包括以下步驟：

（1）實時熒光RT-PCR反應體系配置：10×RT-PCR buffer 2μL，25 mmol/L MgCl₂ 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10μmol/L探針0.5μL，5 U/μLDNA聚合酶 0.5μL，5 U/μL逆轉錄酶 0.5μL，40 U/μL RNA酶抑制劑 0.5μL，待測樣品RNA 4μL，然后加入DEPC水7.5μL，使反應總體積為20.0μL；

（2）實時熒光RT-PCR反應程序：50℃ 反轉錄30 min；95℃預變性 5 min；95℃ 變性15s，61℃ 退火30 s，共40個循環，在61 ℃進行單點熒光檢測；

（3）結果判定：陰性對照無Ct值且無擴增曲線，同時陽性對照Ct值≤35，并且出現典型的擴增曲線，說明實驗為有效實驗，否則實驗無效；在實驗有效的情況下，待測樣品無Ct值且無擴增曲線，表示樣品中不含猴馬爾堡病毒；待測樣品Ct值≤35，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中含有猴馬爾堡病毒；待測樣品Ct值＞35，則對該樣品重復檢測：重復檢測結果無Ct值則該樣品不含猴馬爾堡病毒；重復檢測結果有Ct值則該樣品中含有猴馬爾堡病毒。