[發(fā)明專利]一種m6A修飾RNA檢測方法及用途

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• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN111434777A
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付漢江;鄭曉飛;蘇晨
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種檢測生物或醫(yī)學(xué)樣品中m6A修飾RNA的方法。該方法的特征在于其是基于利用YTHDF2蛋白結(jié)合RNA分子m6A的特性，分離帶有m6A修飾的RNA分子，進而通過PCR擴增技術(shù)檢測m6A修飾的RNA分子。本方法可以用于生物或醫(yī)學(xué)樣品中m6A修飾RNA的檢測分析。

技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及m6A修飾RNA檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù) RNA的堿基修飾超過100種，其中最為普遍存在的是N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾，其發(fā)生在原核生物和真核生物的多種RNA中，包括mRNA、rRNA、tRNA和miRNA等。研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾影響RNA的剪接、翻譯、定位和降解等重要生物學(xué)進程。在人體免疫、造血功能、神經(jīng)細胞的發(fā)育等過程中具有重要的調(diào)控作用，在包括腫瘤在內(nèi)多種疾病發(fā)生和發(fā)展過程中同樣發(fā)揮重要作用。在細胞和生物體內(nèi)m6A修飾水平處于動態(tài)變化過程中，因此，檢測分析m6A修飾RNA變化可以闡釋其生物學(xué)功能，對疾病的診斷和治療靶標分子的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

目前已發(fā)展出了不同的檢測m6A修飾RNA的檢測方法，且各具特點，但也存在著不足。最為常用的分離m6A修飾的RNA分子的方法是使用抗m6A的抗體對m6A修飾的RNA進行親和純化分離制備，再進行后續(xù)的檢測分析。但是，由于現(xiàn)有m6A抗體的價格昂貴，篩選新的特異性m6A抗體難度大，限制了其在大規(guī)模樣本檢測分析中的應(yīng)用。因此，建立m6A抗體的替代分離m6A修飾RNA方法就十分必要。

近來研究已經(jīng)表明含有YTH(YT521-B)結(jié)構(gòu)域家族蛋白被鑒定為m6A的“讀碼器”，特別是YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)具有天然特異性結(jié)合m6A的功能(Zhu T，et al.Crystal structure of the YTH domain of YTHDF2 revealsmechanism for recognition of N6-methyladenosine.Cell Res.2014，24(12)：1493-1496；Li F，et al.Structure of the YTH domain of human YTHDF2 in complex withan m(6)A mononucleotide reveals an aromatic cage for m(6)A recognition.CellRes.2014，24(12)：1490-1492)。YTHDF2結(jié)合m6A的特點為建立分離純化m6A修飾RNA分子的新方法提供了有利條件。

發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明的目的是建立一種簡便的分離純化m6A修飾RNA分子的方法，并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)對m6A修飾RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)的檢測分析。本發(fā)明的分離純化和檢測分析方法，其特征在于利用YTHDF2蛋白結(jié)合m6A修飾RNA的特性，使用YTHDF2蛋白替代已有方法中使用的抗m6A抗體分離純化m6A修飾的RNA分子，通過反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)檢測分析m6A修飾的RNA分子。

該m6A修飾RNA檢測方法包括三個主要步驟，(1)YTHDF2蛋白結(jié)合并分離m6A修飾的RNA分子；(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(3)PCR反應(yīng)。依據(jù)PCR反應(yīng)檢測擴增產(chǎn)物方式的不同，可以采用普通PCR反應(yīng)，也可以加入熒光染料或分子信標采用實時定量PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)中可以可以使用一組引物對特定RNA分子進行PCR反應(yīng)，也可以進行多重PCR反應(yīng)檢測不同的RNA分子，或同一RNA分子的不同片段。

在本發(fā)明中的方法中，YTHDF2蛋白的來源為經(jīng)分離純化獲得的人YTHDF2蛋白，或為重組表達的YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白。YTHDF2蛋白可以從培養(yǎng)的人細胞及組織中制備，重組表達的YTHDF2蛋白還可以帶有常用的His標簽、myc標簽、flag標簽，以及其他方便分離純化的標簽，重組蛋白可以在大腸桿菌、昆蟲細胞和人細胞中表達。