[發明專利]一種用于判別和校準高通量測序污染的內標及其應用

在審

• 申請號: 201910024114.2
• 申請日: 2019-01-10
• 公開（公告）號: CN109628568A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 雷向東;鄧麗盈
• 申請（專利權）人: 上海境象生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 董志勇;陸惠中

本發明提供了一種用于判別和校準高通量測序污染的內標以及使用該內標判別和校準高通量測序污染的方法。本發明的內標是長度在幾十到幾百個堿基或堿基對的DNA或RNA片段，每一個樣本對應不同的內標。本發明的內標不僅能精確而可靠的判別和校準高通量測序中的污染，還可以用作測序時的堿基平衡以及用于跟蹤PCR及測序過程中的錯誤率。

技術領域

本發明屬于高通量測序領域，具體地，屬于體外診斷技術領域，涉及一種用于判別和校準高通量測序污染的內標以及使用該內標判別和校準高通量測序污染的方法，以及其他各種用途。

背景技術

高通量測序(NGS)能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，可逆末端終止測序，半導體測序，焦磷酸測序等都屬于高通量測序。

高通量測序的基礎是構建樣本的測序文庫。根據測序的對象，分為DNA文庫和RNA文庫，DNA文庫包括但不限于全基因組文庫、全外顯子組文庫、靶向DNA文庫；RNA的cDNA文庫包括但不限于總RNA文庫、全轉錄組文庫、小RNA文庫、非編碼RNA文庫、靶向RNA文庫。根據文庫構建方法，分成擴增法構建文庫如PCR文庫制備，連接法構建文庫如truseq法文庫構建，轉座子法構建文庫如nextera法文庫制備，濃縮法構建文庫如Enrichment法文庫制備等；無論是那種測序對象、哪種文庫構建方法，在構建測序文庫時都需要用到測序接頭(adapter，負責將需要測序的序列連接在測序芯片上。其一端與測序芯片上錨定的序列互補，另一端根據需要設計，如與引物、index互補)、引物(負責擴增樣本，構建測序文庫)；多樣本混合測序時則都需要用到樣本標簽(barcode或index，index專指6-8個堿基的樣本身份識別序列，本文統一使用index)。測序接頭(adapter)起到橋接作用，其序列的一頭通過堿基識別被固定在測序芯片上，另一頭則根據需要及實驗步驟接上了index、引物和目標序列；引物則根據不同文庫的需要設計，如全基因組文庫通用引物，全外顯子組文庫通用引物，RNA轉化成cDNA文庫后的通用引物，靶向測序引物等等；樣本標簽的作用是多個樣本混合在一個反應池中測序時，區分每個樣本。

由于高通量測序的單位成本比較高，如果每個樣本要測的序列比較少，通常將多個樣本混合成一個“測序樣本”，大大節約測序成本。這就需要用到樣本標簽(index)來區分每個樣本。每個樣本都含有至少1個特異性的樣本標簽，如果樣本太多標簽不夠，也可以采用樣本片段兩頭各1個標簽的組合來決定標簽的唯一性。

然而，在大量樣本混合測序的實際應用的過程中，本發明發現，樣本和樣本之間、標簽和標簽之間可能形成相互污染，例如：在樣本核酸提取過程中造成的樣本相互污染，在標簽合成、純化、使用過程中造成的標簽相互污染。根據近幾年高通量測序業務實際測試情況來看，樣本核酸提取過程中的污染率達到0-50％；標簽合成和純化過程中的污染率達到1-2％，使用過程中的污染率達到0-20％。以上高通量測序業務均在條件合格的GMP實驗室進行，科研環境中污染可能更甚。

問題造成的后果：

在把樣本混合進行測序時，樣本或標簽相互污染可能造成樣本檢測結果的誤讀。通常污染的量占單個樣本的總量比較小，如果用于胚系基因測序，基本沒有影響；然而，當將高通量測序技術應用于體細胞突變、罕見低頻突變，如腫瘤突變檢測、病毒誘導的體細胞突變時，就變得非常棘手：一是在突變早期，突變的細胞只占機體正常細胞的極少數，這時候就無法區分是突變還是樣本或標簽之間的污染造成的樣本誤讀；二是病理組織本身，特別是腫瘤組織本身就在不斷形成新的突變，每種突變占到病理組織細胞總量的極少數，如果樣本或標簽之間相互污染，也給突變的解讀造成了無法排除的干擾。

隨著醫學的發展，采用高通量測序來檢測腫瘤的突變，根據突變結果制定治療方案和用藥建議，已經成為主流趨勢，目前我國已陸續有多個腫瘤突變高通量測序試劑盒獲批。高通量測序的污染問題正亟待控制和規范。

發明內容