[發明專利]一種檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物傳感器及其制備方法

有效

• 申請號: 201910022818.6
• 申請日: 2019-01-10
• 公開（公告）號: CN109752362B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 王玉;李莎莎;劉素;黃加棟;張儒峰;趙一菡;瞿曉南;孫文玉;王業茹;張曼如
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于納米金DNA分子機器與表面增強拉曼散射的生物傳感器。為了解決以上現有技術中檢測UDG活性的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題。一種基于DNA分子機器表面增強拉曼散射檢測UDG活性的生物傳感器，將納米金分子機器與表面增強拉曼相結合，均相反應混合液。制備方法：合成金納米粒子；將Hairpin Probe和Track DNA以及拉曼染料修飾到金納米粒子表面；將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合。利用了內切酶IV的特異性切割實現DNA分子機器開啟，利用表面增強拉曼檢測實現了高靈敏性檢測；利用外切酶Ⅲ，實現了DNA分子機器的循環，起到了信號放大的作用。

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術領域，特別涉及基于DNA分子機器表面增強拉曼散射檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的生物傳感器，還涉及其制備方法。

背景技術

基因組由特定配對的DNA堿基組成，其穩定和準確性是所有生物體的先決條件。然而，DNA堿基的結構特性可能被多種環境因子和內源性活性氧物質破壞，導致基因組不穩定性和誘導癌變。尿嘧啶是DNA中常見的受損堿基，在DNA復制過程中dUTP錯誤摻入或胞嘧啶水解脫氨的結果，從而導致G:C堿基對轉變成A:U堿基對，最終導致基因突變。通常通過堿基切除修復系統中的尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）來修復DNA內的尿嘧啶。尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是一種高度保守的損傷修復酶，它可以通過催化尿嘧啶和DNA骨架之間的糖苷鍵的裂解來特異性地識別和切除尿嘧啶，釋放受損的堿基并產生無堿基位點（AP位點），并最終與其他修復蛋白質協調以完成整個DNA修復。UDG在維持基因組完整性方面發揮著至關重要的作用，而UDG的異常表達與人類免疫缺陷，淋巴瘤，神經變性和癌癥等多種疾病直接相關。因此，精確檢測UDG活性對于生物醫學研究和臨床診斷至關重要。

傳統的UDG活性檢測方法有凝膠電泳法，核酸標記等方法，然而，它們需要復雜的核酸標記和凝膠電泳程序，并且耗時且靈敏度差，很難普遍化。為了克服以上缺陷，一些基于比色和熒光的UDG活性檢測方法發展起來，這些新技術給UDG活性檢測方面帶來了巨大的進步；但要實現更加靈敏、特異性檢測UDG還有待進一步改善。

發明內容

為了實現更加靈敏的、特異性的檢測UDG活性，本申請提出了一種基于雙酶輔助和DNA分子機器介導納米金顆粒聚集檢測DNA糖基化酶的生物傳感器。

一種檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶的生物傳感器，包括納米金溶液、Hairpin Probe、Track DNA、拉曼染料、拉曼染料、均相反應液；

所述的Hairpin Probe、Track DNA序列為：

Hairpin Probe：

5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTATGTAGTAT

CTCTTTTTCUACATACTGTTTTTT-3’ 序列如SEQ No.1所示；

Track DNA: 5’-SH-TTTTGAGATACTACATAC-3’ 序列如SEQ No.2所示；

所述的DNA序列中，Hairpin Probe和Track DNA的5’端修飾-SH；

所述的Hairpin Probe序列5’第67位修飾U。

所述的均相反應液，包括內切酶IV、外切酶Ⅲ、待測物UDG、PBS。

所述的內切酶IV濃度為1 U/mL，所述的外切酶Ⅲ濃度為10U/mL，待測物UDG的濃度為1 U/mL。

所述的PBS為10mM Tris-HCL、50mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH=7.9。

上述生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：