[發明專利]一種用于檢測水貂阿留申病毒(AMDV)的熒光定量PCR試劑盒及其用途

在審

• 申請號: 201910021149.0
• 申請日: 2019-01-09
• 公開（公告）號: CN109652594A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 胡哲;王曉鈞;李俚
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）;哈爾濱維科生物技術有限公司;中華人民共和國哈爾濱海關
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種用于檢測水貂阿留申病毒(AMDV)的熒光定量PCR試劑盒及其用途。所述的試劑盒中含有熒光定量PCR反應試劑以及引物，其中，所述的熒光定量PCR反應試劑中含有EvaGreen染料，所述的引物由上游引物和下游引物組成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。實驗證明使用本發明的試劑盒檢測AMDV，特異性高，重復性好，DNA檢測限量為1拷貝/μL或者3pg/μL，并且可以識別來自國內外全部的AMDV感染品。在對45份臨床血液樣品的檢測應用中發現，本發明EG PCR方法的AMDV檢出率為91.11％，高于現有的TaqMan方法以及常規PCR方法的AMDV檢出率。因此，本發明的提出為水貂阿留申病毒(AMDV)的檢測提供了一種快速、靈敏的病原學檢測方法。

技術領域

本發明涉及一種病毒檢測試劑盒及其用途，特別涉及一種用于檢測水貂阿留申病毒(AMDV)的熒光定量PCR試劑盒及其用途。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

水貂阿留申病(Aleutian Disease of Mink，AMD)又稱漿細胞增多癥(Plasmacytosis)，是農業部動物疫病病種名錄中三類動物疫病、中國-丹麥進境水貂議定書中的必檢疫病項目，該病由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)引起的，它可以感染任何年齡段的水貂，并且病癥呈現出多樣的表現形式。對患急性肺炎的新生仔貂而言，阿留申病毒幾乎可以導致其100％的死亡率；而對成年水貂，該病通常引起水貂的持續感染，并表現為終生病毒血癥、高蛋白血癥、動脈血管炎和由病毒-抗體復合體誘導的腎小球腎炎和肝炎等。阿留申病毒為單股線狀DNA，在分類上屬于細小病毒科(Parvoviridae)，細小病毒亞科(Parvovirinae)，阿留申病毒屬(Amdovirus)中排名第一的成員，即水貂阿留申病毒(Carnivore amdoparvovirus 1)。水貂阿留申病毒的整個基因組全長約為4.8kb，由兩個開放閱讀框(ORF)組成。左側的L-ORF編碼非結構蛋白(NS)，并參與核酸復制和對結構蛋白合成的調節；右側的R-ORF編碼結構蛋白(VP)，即衣殼蛋白，它同病毒的致病性和對宿主選擇有關。流行病學研究表明，不同的AMDV株在NS和VP基因中均呈現出較高水平的可變性。

由于AMD沒有治療的方法，也沒有疫苗可以進行預防。對該病的控制主要采取“確診-剔除”的方法。目前國內的水貂養殖企業基本采用“中丹協議”中提到的血清學檢測方法——對流免疫電泳(CIEP)對阿留申病進行檢測，然而該方法僅能夠對產生抗體的感染動物進行檢測，卻無法及時發現早期感染未產生足夠抗體水平或攜帶病毒不發病的水貂。盡管這樣的水貂在血清學檢測上是陰性的，但仍可向外排毒并傳染其他易感水貂，無法從根本上切斷阿留申病毒病傳播。而在這種情況下，如果運用病原體檢測方法，AMDV將更容易被鑒別出來。

目前世界范圍內應用的主要分子學檢測方法為常規PCR。1996年，Oie等人在研究AMDV通過浣熊傳播給水貂的過程中，根據VP2基因設計了一對引物。自此以后，在國內外很多AMDV的檢測研究中均使用了這對引物。Jensen等人針對AMDV NS1基因上的一段374bp片段建立了PCR方法，并在2008～2010年間，同CIEP方法對水貂組織樣品進行了檢測結果的差異性比較，結果證實了CIEP方法存在“假陰性”的可能。國內學者許秋等人針對AMDV-NS1基因建立的PCR方法最低能夠檢測到2.53ng/μL的病毒核酸含量。邵西群利用CIEP和PCR方法對自然感染2年的貂場的AMD的流行情況進行檢測對比，發現在水貂感染早期及不產生抗體的AMDV攜帶者中，CIEP容易使結果產生假陰性，進而解釋了利用CIEP方法根除AMDV計劃失敗的原因。此外，楊瑞梅等將膠體金顆粒加入到PCR體系中建立了AMDV的納米PCR檢測方法，該方法可在含毒量低的糞尿樣品中對AMDV進行檢測。