[發(fā)明專利]一種基于SEC-HPLC測定蒜酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910020676.X
• 申請日: 2019-01-09
• 公開（公告）號: CN109596750A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李新霞;李心雨;朱麗
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 代芳

本發(fā)明提供了一種基于SEC?HPLC測定蒜酶的方法，屬于酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，包括：將待測樣品采用SEC?HPLC測定蒜酶；所述SEC?HPLC的色譜條件包括：色譜柱為TSK gel G3000SW_XL，檢測波長為325nm，流動相為磷酸鹽緩沖液，流速為0.1～1mL/min，柱溫為20～30℃，進(jìn)樣量為10～20μL。采用SEC?HPLC法分別測定蒜酶提取物、大蒜凍干粉和鮮蒜中的蒜酶，分別檢測到蒜酶和蒜酶亞基，而經(jīng)過提取純化后的蒜酶提取物中的蒜酶亞基含量減少，與SDS?PAGE法相比，不用破壞蒜酶結(jié)構(gòu)，并且分別測到蒜酶和蒜酶亞基的存在。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于SEC-HPLC測定蒜酶的方法。

背景技術(shù)

大蒜(Allium sativumL.)為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是一種具有悠久歷史的藥食兩用植物。蒜氨酸裂解酶(Alliinase，EC4.4.1.4)簡稱蒜酶，是用來催化大蒜中活性成分蒜氨酸，使其裂解生成大蒜辣素，大蒜辣素是目前公認(rèn)的大蒜活性成分，具有多種藥理活性作用。蒜氨酸酶相對分子質(zhì)量為108KDa，大蒜粉末中蒜酶有兩個相同的亞基結(jié)構(gòu)分子量為54KDa?，F(xiàn)有技術(shù)中，常采用還原型SDS-PAGE凝膠電泳法測定蒜酶分子量及蒜酶在總蛋白里的含量，但是由于蒜酶結(jié)構(gòu)為雙亞基結(jié)構(gòu)，在電泳測定前加入的載樣緩沖液會使得蒜酶中二硫鍵斷裂而最終檢測出的蒜酶為蒜酶亞基。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于SEC-HPLC測定蒜酶的方法，采用本發(fā)明提供的方法，不用破壞蒜酶的結(jié)構(gòu)，就能夠檢測蒜酶，而且還能夠分別測定蒜酶和蒜酶亞基。

本發(fā)明提供了一種基于SEC-HPLC測定蒜酶的方法，包括：將待測樣品采用SEC-HPLC測定蒜酶；

所述SEC-HPLC的色譜條件包括：色譜柱為TSKgel G3000SW_XL，檢測波長為325nm，流動相為磷酸鹽緩沖液，流速為0.1～1mL/min，柱溫為20～30℃，進(jìn)樣量為10～20μL。

優(yōu)選的，所述色譜柱的規(guī)格包括：所述色譜柱的內(nèi)徑為7.8mm，所述色譜柱的柱長為300mm，所述色譜柱的填料粒徑為7μm。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.05～0.15mol/L。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1mol/L。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液的組分包括磷酸氫二鈉和磷酸氫二鉀。

優(yōu)選的，所述流速為0.5mL/min。

優(yōu)選的，所述柱溫為25℃。

優(yōu)選的，所述進(jìn)樣量為15μL。

本發(fā)明提供了一種基于SEC-HPLC測定蒜酶的方法，包括：將待測樣品采用SEC-HPLC測定蒜酶；所述SEC-HPLC的色譜條件包括：色譜柱為TSK gel G3000SW_XL，檢測波長為325nm，流動相為磷酸鹽緩沖液，流速為0.1～1mL/min，柱溫為20～30℃，進(jìn)樣量為10～20μL。實驗采用色譜技術(shù)應(yīng)用于高效凝膠滲透色譜的檢測方法測定蒜酶，供試品中的蒜酶提取物和大蒜凍干粉中的蒜酶均是含有二聚體結(jié)構(gòu)、亞基結(jié)構(gòu)和凝集素的混合物。所以實驗采用凝膠色譜柱的分子篩原理，按照分子量大小對蒜酶供試品中的各個分子蛋白質(zhì)進(jìn)行分離檢測而不破壞其結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明實施例的結(jié)果顯示：采用SEC-HPLC法分別測定蒜酶提取物、大蒜凍干粉和鮮蒜中的蒜酶，在大蒜樣品中分別檢測到蒜酶和蒜酶亞基的存在，而經(jīng)過提取純化后的蒜酶提取物中的蒜酶亞基含量減少，與常規(guī)還原型SDS-PAGE法測定蒜酶相比，不用破壞蒜酶結(jié)構(gòu)，并且可以分別測到蒜酶和蒜酶亞基的存在，為進(jìn)一步探索蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生大蒜辣素的機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

附圖說明