[發(fā)明專利]RNA純化試劑盒及富集miRNA的方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910020384.6 | 申請(qǐng)日： | 2019-01-09 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN109679947A | 公開(kāi)（公告）日： | 2019-04-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 劉標(biāo);楊旭;吳莉萍;辜清泉;姜盼盼 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 深圳瑞奧康晨生物科技有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/10 | 分類號(hào)： | C12N15/10;C12N15/113;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281 | 代理人： | 張海平;彭家恩 |
| 地址： | 518008 廣東省深圳市鹽田區(qū)海山*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說(shuō)明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 試劑盒 富集 懸浮溶液 玻璃粉 酸處理 總RNA 緩沖劑 申請(qǐng) 選擇性富集 血清miRNA 測(cè)序過(guò)程 后續(xù)處理 試劑處理 提取純化 超純水 高通量 離液鹽 建庫(kù) 溶質(zhì) 血漿 | ||
1.一種RNA純化試劑盒，其特征在于，所述RNA純化試劑盒包括酸處理玻璃粉和懸浮溶液，所述酸處理玻璃粉具有325目或更細(xì)的粒度，所述懸浮溶液以超純水為溶質(zhì)，包含0.2-1M的離液鹽和0.05-0.2M的緩沖劑，pH 5-7。
2.權(quán)利要求1所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述離液鹽為氯化鋰、硫氰酸鉀、高氯酸鈉或者它們的組合。
3.權(quán)利要求1所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述緩沖劑為氯化銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉或者它們的組合。
4.權(quán)利要求1所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述懸浮溶液還包含0.05-2mM的EDTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述懸浮溶液包含0.5M的氯化鋰、0.1M的氯化銨和1mM的EDTA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述酸處理玻璃粉和所述懸浮溶液分裝在不同的試劑瓶中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的RNA純化試劑盒，其特征在于，所述酸處理玻璃粉和所述懸浮溶液混合在同一個(gè)試劑瓶中形成RNA純化試劑，所述酸處理玻璃粉和所述懸浮溶液的重量體積比為1g:(3-5)ml。
8.一種從含有總RNA的水溶液中富集miRNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供含有總RNA的水溶液；
(2)將根據(jù)權(quán)利要求6所述的RNA純化試劑盒中的所述酸處理玻璃粉和所述懸浮溶液混合以現(xiàn)配RNA純化試劑，其中所述酸處理玻璃粉和所述懸浮溶液的重量體積比為1g:(3-5)ml；或者提供根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNA純化試劑盒的配好的RNA純化試劑；
(3)向所述含有總RNA的水溶液中加入0.6-1倍體積的所述RNA純化試劑，混勻，得到第一混合液，在4℃下放置5-15分鐘；
(4)將所述第一混合液在4℃、5000-8000rpm下離心5-15分鐘，取上清液，加入0.75-1倍體積的異丙醇，并加入10-20μg糖原，得到第二混合液；
(5)將所述第二混合液置于-80℃下至少2h，然后融化，在4℃、10000-15000rpm下離心30-40分鐘，棄去上清液；
(6)向所得的沉淀物加入預(yù)冷的70％乙醇，混勻，在4℃、10000-15000rpm下離心10-15分鐘，棄去上清液；
(7)重復(fù)步驟(6)一次，棄去上清液，將底部具有沉淀物的離心管在4000-6000rpm下瞬時(shí)離心5s后，使用小量程移液器徹底棄去上清液，室溫干燥2-5分鐘，得到富集了miRNA的沉淀物；
(8)任選地，向所述富集了miRNA的沉淀物加入適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，室溫靜置2-5分鐘后，混勻，得到富集了miRNA的水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述提供含有總RNA的水溶液包括：
(A)提供含RNA的樣品；
(B)向1體積份的所述含RNA的樣品加入2-2.5體積份的Trizol Reagent，混勻，室溫靜置5-10分鐘；
(C)向步驟(B)所得的混合液中加入0.8-1體積份的異丙醇，混勻，室溫靜置5-10分鐘；
(D)將步驟(C)所得的混合液在4℃、10000-15000rpm下離心10-15分鐘，取上清液至新的離心管中；
(E)向1體積份的所得上清液加入2-2.5體積份的氯仿，混勻，室溫靜置5-10分鐘；
(F)將步驟(E)所得的混合液在4℃、10000-15000rpm下離心10-15分鐘，取上清液至新的離心管中；
(G)重復(fù)步驟(E)和(F)一次，得到所述含有總RNA的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述含RNA的樣品為血漿或者血清。
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