[發(fā)明專利]一種筒狀蛋白納米反應(yīng)器在顯色檢測(cè)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910020249.1
• 申請(qǐng)日: 2019-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN109724969B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小強(qiáng);楊偉娟;張輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島古高生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開了一種筒狀蛋白納米反應(yīng)器在顯色檢測(cè)中的應(yīng)用，以四甲基聯(lián)苯二胺為發(fā)色底物，在筒狀蛋白納米反應(yīng)器內(nèi)，H₂O₂還原成H₂O，四甲基聯(lián)苯二胺被氧化為藍(lán)色的二亞胺化合物，644nm處產(chǎn)生特征吸收峰；加入濃硫酸后，顯色反應(yīng)終止，通過450nm處的吸收峰進(jìn)行定量分析；筒狀蛋白納米反應(yīng)器主體為兩端開口的筒狀蛋白，并且筒狀蛋白兩端開口處內(nèi)表面通過疏水作用結(jié)合具有催化活性的疏水客體；筒狀蛋白的筒壁為多孔結(jié)構(gòu)。將筒狀蛋白納米反應(yīng)器應(yīng)用于顯色檢測(cè)可通過納米尺寸效應(yīng)提高監(jiān)測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物納米技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種筒狀蛋白納米反應(yīng)器在顯色檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

常見的納米反應(yīng)器大體可以分為四大類，即反相微乳液、嵌段共聚物、多孔材料和層狀鹽酸鹽。但人工合成納米結(jié)構(gòu)的精致性、均一性和單分散性均無法與基于蛋白籠的蛋白納米反應(yīng)器相比較。

利用成熟的分子生物學(xué)技術(shù)，人們可以方便地克隆出納米蛋白籠組成單元的基因，并且可以利用異源表達(dá)體系大量合成出重組蛋白納米籠，進(jìn)而為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

目前，顯色檢測(cè)是一種廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法，其簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、靈敏度高。而納米反應(yīng)器會(huì)產(chǎn)生納米尺寸效應(yīng)，顯著提高反應(yīng)速率。因此，如何將蛋白籠構(gòu)筑的單分散性納米反應(yīng)器應(yīng)用于顯色檢測(cè)中、結(jié)合敏感的色原底物提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種筒狀蛋白納米反應(yīng)器在顯色檢測(cè)中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高準(zhǔn)確率的檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種筒狀蛋白納米反應(yīng)器在顯色檢測(cè)中的應(yīng)用，以四甲基聯(lián)苯二胺為發(fā)色底物，在筒狀蛋白納米反應(yīng)器內(nèi)，H₂O₂還原成H₂O，四甲基聯(lián)苯二胺被氧化為藍(lán)色的二亞胺化合物，644nm處產(chǎn)生特征吸收峰；加入濃硫酸后，顯色反應(yīng)終止，通過450nm處的吸收峰進(jìn)行定量分析；

筒狀蛋白納米反應(yīng)器主體為兩端開口的筒狀蛋白，并且筒狀蛋白兩端開口處內(nèi)表面通過疏水作用結(jié)合具有催化活性的疏水客體；筒狀蛋白的筒壁為多孔結(jié)構(gòu)。

以四甲基聯(lián)苯二胺為發(fā)色底物可配制成液體試劑儲(chǔ)存，使用安全方便，且具有較高的檢測(cè)敏感性。

筒狀蛋白兩端開口，筒壁為多孔結(jié)構(gòu)，底物分子既可從兩端進(jìn)入筒狀蛋白的空腔進(jìn)行反應(yīng)，又可穿過筒壁進(jìn)入空腔；該結(jié)構(gòu)同樣有利于產(chǎn)物的釋放。

優(yōu)選地，顯色檢測(cè)具體步驟為：

將20μM筒狀蛋白納米反應(yīng)器溶液與3mM四甲基聯(lián)苯二胺溶液等體積混合，靜置10min，得到混合液；

之后加入混合液一半體積的含H₂O₂的溶液，30℃水浴鍋中孵育20min；

孵育后加入體積分?jǐn)?shù)20％的硫酸終止顯色反應(yīng)，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量450nm處的吸光度；以H₂O₂濃度為橫坐標(biāo)，450nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

檢測(cè)未知溶液中H₂O₂含量時(shí)，測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出H₂O₂濃度。

優(yōu)選地，筒狀蛋白納米反應(yīng)器內(nèi)徑4.5nm，外徑14nm，高14.6nm。

優(yōu)選地，筒狀蛋白納米反應(yīng)器的制備方法包括如下步驟：