[發明專利]有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留污染土壤生態毒性的測定方法

在審

• 申請號: 201910015195.X
• 申請日: 2019-01-08
• 公開（公告）號: CN109580913A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 周世萍;楊發忠;劉永梅;劉守慶;梁坤;雷然;朱國磊;郭佳葳;袁智勇;呂天雯;夏紅云
• 申請（專利權）人: 西南林業大學
• 主分類號: G01N33/24
• 分類號: G01N33/24;G01N33/68
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 張亦凡

1.有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留污染土壤生態毒性的測定方法，其特征在于該方法通過以下方式實現：

1）實驗蚯蚓為赤子愛勝蚓，將實驗蚯蚓放置在未污染土壤中進行馴養7-10天，挑選三月齡以上、體長5～6cm，體重350～400mg的蚯蚓為實驗蚯蚓；

2）將實驗蚯蚓放置在未污染土壤中進行馴養7-10天，挑選三月齡以上、體長5～6cm，體重350～400mg的蚯蚓為實驗蚯蚓；

3）暴露試驗：在裝有待測土壤的培養箱中放置一定數量的實驗蚯蚓進行暴露實驗，以裝有未污染土壤的培養箱中相同數量的實驗蚯蚓為對照組，暴露時間為4小時；

4）蛋白提取：暴露試驗處理的蚯蚓以高純水洗去殘留農藥后，加入5ml蛋白提取液，進行冰浴研磨提取，其勻漿離心12000rpm，4℃離心5min，取上清液；

5）SDS-PAGE分離蛋白：分離膠的濃度選擇為14%，其10ml配方如下：A液：4.7ml；B液：2.5ml；高純水：2.8ml ；壓縮膠的濃度選擇為5%，其4ml配方如下：高純水：2.3ml；A液：0.67ml；C液：1.0ml；A液、B液、C液的組成如下：

A液：稱取29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉雙丙烯酰胺，溶于水后，用水定容至100ml，置于冰箱內4℃下保存備用；

B液：量取75ml、2mol/L、pH8.0的三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽和4ml 10%十二烷基磺酸鈉，用水定容至100ml，置于冰箱內4℃下保存備用；

C液：量取50ml、1mol/L、pH6.8的三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽和4ml 10% 十二烷基磺酸鈉，用水定容至100ml，置于冰箱內4℃下保存備用；

將步驟3）的蛋白提取液于100℃沸水浴加熱5min，13000rpm下離心1min后上樣，電流設置在180V，溴酚藍前沿進分離膠后電壓提高至200V，進行電泳分離至溴酚藍染料到達分離膠底部，關閉電源；取出凝膠，采用考馬斯亮藍R-250染色，在搖床上振蕩染色過夜，倒出染色液，將凝膠浸入脫色液中脫色；

6）Western Blotting檢測：按步驟4）的凝膠大小裁剪Whatman濾紙和NC膜，將裁剪后的Whatman濾紙和NC膜，分別放入轉印緩沖液中平衡10~15min和30min浸泡平衡；按凝膠大小裁剪Whatman濾紙，成45度角緩慢放入轉印緩沖液中平衡10~15min；按凝膠大小剪NC膜， NC膜成45度角緩慢放入轉印緩沖液中浸泡平衡30min；從下到上依次將Whatman濾紙、NC膜、凝膠、Whatman濾紙順序整齊疊放，制備轉移膜；將制好的轉移膜轉移至半干轉印槽中，設置電壓為穩壓20V，轉移時間為50min進行轉膜；將轉印后的NC膜用TBS-T液在恒溫搖床上搖動清洗3次，每次15min，之后用10%的小牛血清蛋白- TBS-T在4℃下浸泡過夜，進行清洗及封堵，倒出封堵液，以TBS-T液搖床清洗3次后，將NC膜放入一抗工作液中，于恒溫搖床37℃孵育2h進行一抗孵育，再以TBS-T液清洗NC膜，清洗除去未結合的一抗后，放入1：1000的二抗工作液中，于恒溫搖床37℃孵育1.5h，洗膜3次后放入顯色工作液，顯色10~30min，若無信號出現則可繼續顯色；顯色完畢后用高純水洗滌NC膜終止反應，NC膜晾干后用掃描儀掃描；印跡結果掃描后分析純度；若測試組與對照組存在顯著差異p＜0.05，表明測試土壤中農藥殘留對土壤生物生長具有毒性，如不存在顯著差異，則測試土壤不具有生長毒性。